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Untersuchungen zur Funktion und Lokalisation des Proteins Suppressor of Cytokine Signaling 1 (SOCS1) in Zellen des angeborenen Immunsystems

Bätz, Andrea

English Title: Investigations to function and localization of the protein suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1) in cells of the innate immune system

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Abstract

Suppressor of cytokine signaling (SOCS) Proteine stellen eine Klasse von induzierbaren Feedback-Inhibitoren für den JAK/STAT (janus kinase / signal transducer and activator of transcription) Signalweg dar. Diese intrazellulären Proteine können durch Zytokine, aber auch nach Stimulation von Toll-like Rezeptoren (TLR) induziert werden. Neuere Daten weisen darauf hin, dass SOCS-Proteine wichtige Negativregulatoren im TLR-Signalweg darstellen. Allerdings ist der genaue Mechanismus der SOCS-Induktion und Wirkungsweise nach TLR-Stimulation noch umstritten. Im ersten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass SOCS-Proteine (SOCS1, SOCS3, CIS) durch prototypische TLR-Liganden [LPS, LTA, CpG-ODN, Poly(I:C)] induziert werden können. Dabei war die Induktion der Proteine SOCS3 und CIS von MyD88 abhängig. Für das SOCS1-Protein zeigten sich dagegen TLR-abhängige Unterschiede. Die Induktion der SOCS-Proteine erfolgte direkt und war unabhängig von der Wirkung von Typ I Interferon. In SOCS-überexprimierenden Makrophagen konnte nach TLR-Stimulation kein inhibitorischer Effekt der Proteine SOCS1, SOCS2, SOCS3 oder CIS auf das direkte TLR-Zielgen TNF-alpha (Tumor Nekrose Faktor alpha) nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass nach Stimulation von TLR2, TLR3, TLR4 und TLR9 die Expression von IFN-alpha induziert wird. Dieses wird von der Zelle sezerniert, bindet in einem auto-/parakrinen Mechanismus an seinen entsprechenden Rezeptor und führt über die Aktivierung des JAK/STAT-Signalwegs zur Induktion von sekundären Genen, wie z.B. IP-10. Dieser, durch TLR-Liganden induzierte, indirekte Signalweg konnte durch das SOCS1-Protein und in geringem Umfang auch von den Proteinen SOCS3 und CIS inhibiert werden. Mit diesen Daten konnte gezeigt werden, dass die nach TLR-Stimulation induzierten SOCS-Proteine den direkten TLR-Signalweg nicht beeinflussen, sondern ihre inhibitorische Wirkung auf den indirekten, IFN-alpha-abhängigen Signalweg ausüben. Anschließend wurde die Lokalisation der SOCS-Proteine in der Zelle untersucht. Dafür wurden Fusionsproteine bestehend aus GFP und SOCS konstruiert. Überraschenderweise konnte für SOCS1, aber nicht für SOCS3 oder CIS, eine deutliche Kernlokalisation in verschiedenen Zellen nachgewiesen werden. Mit Hilfe einer Sequenzanalyse konnte ein putatives nukleäres Lokalisationssignal (NLS) zwischen der SH2-Domäne und der SOCS-Box von SOCS1 identifiziert werden. Deletion oder Substitution dieser Region mit der entsprechenden Sequenz aus SOCS3 sowie eine Serie von R/A-Punktmutationen führten zu einem verstärkten zytoplasmatischen Expressionsmuster. Weiterhin bewirkte die Insertion der NLS aus SOCS1 in das normalerweise zytoplasmatisch-lokalisierte CIS-Protein eine nukleäre Expression. Interessanterweise waren die generierten SOCS1-Mutanten trotz Unterschieden in der Lokalisation noch in der Lage, wenn zum Teil auch etwas abgeschwächt, die IFN-alpha-vermittelte STAT1-Aktivierung (Tyrosin-Phosphorylierung, Reportergen-Aktivität) zu inhibieren. Die funktionale Signifikanz von nukleär exprimiertem SOCS1 bleibt unklar und wird ausgiebig diskutiert. Es scheint sich um eine neuartige Funktion von SOCS1 zu handeln, die unabhängig von dem bekannten Effekt der SOCS-Proteine im JAK/STAT-Signalweg ist.

Translation of abstract (English)

Suppressor of cytokine signaling (SOCS) proteins constitute a class of inducible feedback inhibitors for janus kinase / signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) pathways. These intracellular proteins are induced by cytokine signaling, but they can also be induced by stimulation of Toll-like receptors (TLR). It has been suggested that SOCS proteins are important negative regulators of TLR signaling. However, the way of induction and inhibition is still contoversly discussed. In this study it is shown that prototypic TLR ligands [LPS, LTA, CpG-ODN, Poly(I:C)] induce expression of SOCS proteins (SOCS1, SOCS3, CIS). This induction of SOCS3 and CIS was strictly MyD88 dependent but showed differing needs in the case of SOCS1. However, induction of SOCS proteins by TLR ligands was independent of secreted type I interferon. In macrophages overexpressing SOCS, we were not able to observe an inhibitory effect of SOCS1, SOCS2, SOCS3 or CIS on prototypical TLR target genes such as tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha). In addition, it is shown that TLR2, TLR3, TLR4 and TLR9 stimulation induced interferon alpha (IFN-alpha), which is able to exert auto-/paracrine signaling, leading to the activation of secondary genes like IP-10. SOCS1 and, to a lesser extent, SOCS3 and CIS were able to inhibit this indirect signaling pathway following TLR stimulation. Thus, these data suggest that SOCS proteins induced by TLR stimulation limit the extent of TLR signaling by inhibiting paracrine type I IFN signaling. Subsequently, we analyzed the localization of different SOCS proteins in the cell. Therefore we constructed fusion proteins consisting of SOCS and GFP. Surprisingly, it was observed that SOCS1 but not SOCS3 or CIS localized predominantly to the nucleus when expressed in various cell lines. Sequence analysis revealed a putative bipartite nuclear localization signal (NLS) located between the SH2 domain and the SOCS-box of SOCS1. Deletion of this region, introduction of a series of R/A point mutations or substitution of this sequence with the respective region of SOCS3 resulted in loss of nuclear and increasing cytoplasmic localization. Fusion of the SOCS1-NLS to CIS resulted in nuclear localization of this otherwise cytoplasmic protein. Interestingly, the generated mutants of SOCS1 were still partly effective in suppressing IFN-alpha mediated STAT1 (tyrosine phosphorylation; reporter gene activity) activation despite of differences in their localization. However, the functional significance is presently unclear and probably independent on the wellknown effects of SOCS on JAK/STAT signaling.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bartenschlager, Prof. Dr. Ralf
Date of thesis defense: 11 October 2007
Date Deposited: 23 Oct 2007 12:21
Date: 2007
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Hygiene-Institut
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Toll-like-Rezeptoren, Grün fluoreszierendes Protein, Mutation
Uncontrolled Keywords: NLS , JAK/STAT-SignalwegToll-like receptors , green fluorescent protein , mutation , NLS , JAK/STAT
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