Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

The Role of Protein Palmitoylation for Protein Function at the Yeast vacuole

Subramanian, Kanagaraj

German Title: Die Rolle des Proteins Palmitoylation für Protein-Funktion an der Hefe-Vakuole

[thumbnail of Kanagaraj_Ph.D_Thesis_21_08_07.pdf]
Preview
PDF, English
Download (10MB) | Terms of use

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the DOI, URN or the persistent URL below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

Der Stoffaustausch zwischen den Organellen eukaryotischer Zellen basiert auf dem geordneten Transport von Vesikeln. Diese entstehen durch Abschnürung der Membran des Donor-Kompartiments, nachdem die zu transportierende Fracht spezifisch angereichert worden ist. Die Vesikel fusionieren nach Erreichen des Ziel-Kompartiments mit dessen Membran und geben ihren Inhalt an das Innere des Kompartiments ab. Ein Großteil der Proteine, die eine Rolle beim vesikulären Trafficking spielen sind periphere Membranproteine, die aus dem Cytosol rekrutiert werden. Diese Proteine benötigen Membranrezeptoren, spezifische Lipide oder Lipidanker, um an die Membran zu binden. In meiner Doktorarbeit habe ich Lipidmodifikationen, die die physikalischen und funktionalen Eigenschaften von Proteinen beeinflussen, näher untersucht. Palmitoylierung ist eine Lipidmodifikation, die die Membranassoziierung von Proteinen erleichtert. Es handelt sich dabei um eine reversible Anbindung eines Palmitatrestes durch eine Thioesterbindung an die Thiolgruppe eines Cysteins im Zielprotein. Neben seiner Funktion als Membrananker beeinflusst der Palmitatrest die Funktion des angebundenen Proteins. Als Modellsystem wählte ich die Vakuole der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, die in ihrer Funktion den Lysosomen höherer Eukaryoten entspricht. Das vakuoläre Hefeprotein Vac8 ist palmitoyliert und wird in der Zelle für die Vakuolenfusion, die Kontrolle der Vakuolenmorphologie und die Weitergabe von Vakuolen an die Tochterzelle bei der Zellteilung, im folgenden Vererbung genannt, benötigt. In meinen Studien habe ich zwei wichtige Aspekte der Vac8-Palmitoylierung im Besonderen untersucht: (i) wie beeinflusst die Palmitoylierung die Funktion von Vac8 und (ii) auf welche Weise wird die Palmitoylierung von Vac8 reguliert? 1.Der Einfluß der Palmitoylierung auf die Funktion von Vac8. Vac8 beinhaltet eine N-terminale Src homology (SH) 4 Domäne, in der sich die Aminosäurereste befinden, die myristoyliert und palmitoyliert werden. In den meisten Fällen werden Proteine jeweils einmal myristoyliert und palmitoyliert, um stabil in der Membran verankert zu werden. Vac8 besitzt demgegenüber drei potentielle Palmitoylierungsstellen (Cysteine 4, 5 und 7) und es stellte sich die Frage, ob die drei Cysteine individuelle Funktionen erfüllen. Um diese Frage zu beantworten wurden Mutanten generiert, in denen entweder einzelne oder mehrere Cysteine durch Alanin ersetzt wurden. Dabei stellte sich heraus, das Mutanten mit nur einem Cystein, respektive einer Palmitoylierungsstelle, einen stark veränderten Phänotyp hinsichtlich der Proteinlokalisation und –funktion aufweisen, wobei die Position des Cysteins entscheidend für eine effiziente Palmitoylierung ist. Zur Untersuchung der Bedeutung der Palmitoylierung für die Funktion von Vac8 wurde das Protein mit der Src SH4 Domäne versehen, die myristoyliert wird aber statt der Palmitoylierungsstelle einen Abschnitt mit mehreren basischen Aminosäuren enthält. Diese Chimäre lokalisierte zwar wie erwartet auf der Vakuolenmembran, konnte aber eine Vac8 Deletion nicht funktionell komplementieren. Nur durch die Addition eines einzelnen Cysteins in der Src SH4 Domäne konnte die Wildtyp Funktion wiederhergestellt werden. Aufgrund der gewonnen Daten lässt sich daher sagen, dass die Palmitoylierung die Funktion von Vac8 entscheidend beeinflusst. 2.Der Effekt des DHHC Proteins Pfa3 auf die Palmitoylierung von Vac8. In vorhergehenden Studien wurde gezeigt, dass das SNARE-Protein Ykt6 die Palmitoylierung von Vac8 in einer nicht-enzymatischen Reaktion vermitteln kann. Demgegenüber ist die enzymatische Acylierungsreaktion von Vac8 bislang noch weitgehend unverstanden. Das vakuoläre Protein Pfa3 gehört zur Familie der DHHC Transmembranproteine, deren Mitglieder Proteinacyltransferase-Aktivität aufweisen. Daher wurde es als ein Zielprotein gewählt, dessen Einfluss auf die Palmitoylierung von Vac8 näher untersucht wurde. Tatsächlich konnte ich in meinen Studien nachweisen, dass Pfa3 spezifisch zur Palmitoylierung von Vac8 beiträgt. Eine Palmitoylierung anderer vakuolärer Proteine durch Pfa3 konnte demgegenüber nicht nachgewiesen werden. Pfa3 wird nicht für die Vererbung der Vakuole benötigt, muss aber für eine effiziente Vakuolenfusion vorhanden sein. Neben seiner Funktion als Proteinacyltransferase fungiert es als Vakuolen-Sortierungsfaktor für Vac8 und Proteine mit einer Src SH4 Domäne. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das DHHC Protein Pfa3 die Palmitoylierung und die Funktion des Vac8 Proteins beeinflusst.

Translation of abstract (English)

In eukaryotic cells, organelles communicate with each other by means of regulated vesicular transport. Vesicles loaded with cargo bud from the donor compartment and deliver their load upon fusion with the target membrane. Most of the proteins involved in the vesicular trafficking are peripheral membrane proteins, recruited from the cytosol. These proteins depend on membrane receptors, lipids or lipid anchors for binding to the membranes. In my research, I focused on the lipid modifications that alter the physical and functional properties of the protein. One type of lipid modification is palmitoylation, which facilitates the membrane association of the protein. Palmitoylation is the reversible addition of palmitate to the cysteine residue of the protein through a thioester linkage. Besides functioning as membrane anchor, palmitate influences the protein’s functions. For my study, I used the budding yeast vacuoles as a model system, which is equivalent to lysosomes in higher organisms. The yeast vacuolar protein Vac8 is palmitoylated and required for vacuole fusion, morphology and inheritance. Specifically, I studied two important issues of Vac8 palmitoylation: (i) how does palmitoylation affect the function of Vac8? (ii) how is palmitoylation of Vac8 regulated? 1. Role of palmitoylation for Vac8 function. Vac8 contains an N-terminal Src homology (SH) 4 domain region, which harbors the sites for myristoylation and palmitoylation. For most of the proteins, a combination of myristate and one palmitate is sufficient for stable membrane anchoring. Interestingly, Vac8 has three cysteines in the SH4 domain and so we asked whether these cysteines have any individual function. To study this, we mutated the cysteines individually or in combination to alanines and examined the different functions of Vac8. Surprisingly, Vac8 with a single cysteine showed a dramatic difference in the localization and functions. The position of cysteine is critical for the palmitoylation of Vac8. Furthermore, we investigated the importance of palmitoylation for Vac8 function. We targeted Vac8 to the vacuole via the Src SH4 domain (myristate/polybasic domain). This protein localized to vacuoles, but did not complement Vac8 function. Only if a single cysteine was added to the Src SH4 domain complete rescue of function was observed. Based on these data, we suggest that palmitoylation determines the function of Vac8. 2. Effects of DHHC protein Pfa3 on Vac8 palmitoylation. The SNARE Ykt6 mediates the palmitoylation of Vac8 in a non-enzymatic reaction. However, the enzymatic acylation of Vac8 is poorly understood. The vacuolar protein Pfa3 belongs to the DHHC family and is known to possess protein acyltransferase activity. We examined protein palmitoylation at the vacuole. Pfa3 contributes specifically to the palmitoylation of Vac8. Interestingly, it does not affect other palmitoylated proteins at the vacuole. Pfa3 is required for vacuole fusion, but not for vacuole inheritance. Besides protein acyltransferase activity, Pfa3 acts as the vacuole-sorting factor for both Vac8 (myristate/palmitate) and Src (myristate/polybasic domain) SH4 domains. Taken together, our data suggest that the DHHC protein Pfa3 affects the palmitoylation and functions of Vac8.

Document type: Dissertation
Supervisor: Brunner, Prof. Michael
Date of thesis defense: 26 October 2007
Date Deposited: 30 Oct 2007 13:53
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
DDC-classification: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Palmitoylation , Vacuole , Protein acyltransferases
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoDINI certificate 2013Logo der Open-Archives-Initiative