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Fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen nukleosomaler Struktur und Dynamik

Hauger, Florian

English Title: Nucleosomal Structure And Dynamics Studied With Fluorescence Spectroscopy

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PDF, German
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Abstract

Das Nukleosom ist der elementare Baustein des Chromatins. Das Chromatin kompaktiert die DNS im Zellkern, dient gleichzeitig aber auch deren Organisation. Eine in diesem Zusammenhang wichtige Eigenschaft des Nukleosoms ist, daß es seine Position auf der DNS verändern kann. Diese Positionsveränderungen ermöglichen es, bestimmte DNS Bereiche für Proteinfaktoren zugänglich zu machen, bzw. zu blockieren. Einerseits ist diese Repositionierung bzw. Remodellierung eine intrinsische Eigenschaft des Komplexes, zusätzlich sind auch eine Vielzahl von Proteinen und Proteinkomplexen beschrieben worden, die diese Remodellierung katalysieren. Der genaue Mechanismus der Remodellierung ist aber noch unklar. Es gibt eine Reihe von Modellen, die z.B. eine lokale Ablösung der DNS vom Histonoktamer postulieren, die um den Komplex diffundieren könnte und so zu einer veränderten Position des Komplexes relativ zur DNS führen würde. Abhängig ist diese Remodellierung unter anderem von der Sequenz der DNS sowie posttranslationaler Modifikationen der Histone. Um diese Remodellierung im Detail zu untersuchen wurden in dieser Arbeit dynamische und strukturelle Eigenschaften des Nukleosoms mit Hilfe von fluoreszenzspektroskopischen sowie biochemischen Methoden untersucht. Es wurde ein \textit{in vitro} Modellsystem verwendet, bei dem Nukleosomen aus rekombinant gewonnenen Histonoktameren und verschiedenen natürlichen sowie synthetischen DNS Abschnitten durch Salzschrittdialyse rekonstituiert wurden. Die DNS wurde an verschiedenen Stellen mit fluoreszierenden Farbstoffen versehen, die Fluoreszenzenergietransfermessungen ermöglichten und so Rückschlüsse über strukturelle und dynamische Eigenschaften des Nukleosoms erlaubten. So konnte Komplexbildung der Nukleosomen mit H1 gemessen werden, die Bewegung des Komplexes während thermischer Mobilisierung an das Ende der DNS konnte verfolgt werden, sowie die Einflüsse veränderter Ionenstärken oder Einbringung von H1 in den Komplex auf die thermische Mobilisierung lies sich beobachten. Mit Einzelmolekülanalysen wurde die Wirkung von Chromatinremodellierungskomplexen und Histonchaperonen, bzw. Enzymen wie ISWI und BRG1 auf das Nukleosom untersucht. Es konnte so auch gezeigt werden, daß Bindung von ISWI oder BRG1 eine Strukturveränderung im Nukleosom hervorruft.

Translation of abstract (English)

The nucleosome is the elemental unit of chromatin. The chromatin not only compacts the DNA into the cell nucleus, but it is also crucial for the organisation of the DNA. An important property of the nucleosome in this aspect is its ability to change position on the DNA. This change of position may render certain parts of DNA accessible or inacessible for protein factors and thus DNA regulation. Catalysed as well as intrinsic repositioning is known to occur, but the underlying mechanisms are not completely resolved. Different models have been proposed to account for the remodeling process: diffusion of DNA bulges along the histone octamer, formation and migration of large DNA loops or bulges inside the DNA-histone complex, and diffusion of DNA twist defects. This remodeling is also dependant on the DNA sequence and histone modifications. To elucidate the process of remodeling, dynamical and structural properties of the nucleosome were studied with fluorescence spectroscopy and biochemical methods in this work. An \textit{in vitro} system was used, where recombinant histone octamers were reconstituted with a set of natural and synthetic nucleosome positioning sequences using salt step dialysis. The DNA was labeled fluorescently to allow the measurement of structural and dynamic properties of the nucleosome. Using this approach it was possible to measure incorporation of H1 into the nucleosome complex, the movement of the complex to the edge of the DNA during thermal mobilisation and also the influence of changes in ionic strength or H1 on this movement. Finally, applying newly developed single molecule techniques it was demonstrated that binding of chromatin remodeling complexes, or components of these such as ISWI or BRG1, resulted in structural changes of the nucleosomal structure.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Langowski, Prof. Dr. Jörg
Date of thesis defense: 4 December 2007
Date Deposited: 12 Dec 2007 15:33
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Nucleosom, Fluoreszenz, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer, Chromatin, Histone, Histone-like proteins, Epigenetik, Laser
Uncontrolled Keywords: Einzelmolekülspektroskopie , Nanometer , MFD , PDA , spFRETMFD , PDA , single molecule spectroscopy , spFRET
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