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Dynamics of telomeres in a telomerase-negative human osteosarcoma cell

Jegou, Thibaud

German Title: Dynamik von Telomeren in Telomerase-negativen humanen Osteosarkomzellen

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Abstract

Die höhere Ordnung der Chromatinorganisation und ihre dynamischen Eigenschaften sind direkt mit Vorgängen wie Genexpression, Replikation, DNA Reparatur und Rekombination verbunden. In dieser Doktorarbeit wurde die Mobilität von Telomeren in einer humanen Osteosarcoma-Zellinie U2OS untersucht, in welche zuvor lacO-Operator Widerholungseinheiten an den Telomeren der Chromosomen 6, 11 und 12 stabil integriert wurden.Die Mobilität dieser drei Telomere wurde während der Interphase mittels Fluoreszenzmikroskopie durch gebundene LacI-Repressoren, welche mit autofluoreszenten GFP oder mRFP1 Domänen fusioniert waren, beobachtet. Durch Messungen der Distanzänderungen zwischen zwei markierten Telomerpaaren mittels Hochgeschwindigkeits-Lebendzellbeobachtung wurde ein begrenztes Diffusionsmodell abgeleitet, welches die Ortsveränderung der Telomere im Zellkern in einer Zeitskala von Millisekunden bis Stunden beschreibt. Drei Arten von Bewegungen wurden identifiziert: (i) Schnelle, lokale Bewegungen im (Milli-)Sekundenbereich mit einer Diffusionskonstante von Dms = 2•10-3 µm2 s-1, welche auf eine Region mit einem Radius von rms ~ 80 nm begrenzt waren, (ii) Bewegungen im Sekunden/Minutenbereich mir Dsec = 4•10-4 µm2 s-1 und rsec = 150 nm und (iii) Bewegungen im Minuten/Stundenbereich mit Dmin = 2•10-5 µm2 s-1. Für die letztgenannten Ortsveränderungen wurden mittlere Begrenzungsradien von rmin = 0.3 ± 0.1 µm bestimmt, wobei ein Anteil von ~ 30% der Telomere eine hohe ausgedehnte Mobilität mit rmin = 0.8 ± 0.4 µm zeigte. Dies legt den Schluss nahe, dass die Mehrheit der Telomere an eine stabile Struktur im Zellkern verankert ist , wogegen sich ein gewisser Anteil der Telomere freier bewegen kann. Darüberhinaus konnten wir zeigen, dass eine Korrelation zwischen einem Teil der Telomere mit kurzen Wiederholungssequenzlängen und Telomeren mit ausgeweiteter Mobilität besteht, was darauf hinweist, dass intakte Telomere zur Verankerung notwendig sind. Zudem wurde die Mobilität von Promyelozytische-Leukämie (PML) - Zellkernkörperchen relativ zu den Telomeren analysiert. Die PML Körperchen formten Komplexe mit den Telomeren in der Telomerase-negativen U2OS Zellinie. Diese wurden schon zuvor beschrieben im Weg einer alternativen Verlängerung von Telomeren (alternative lengthening of telomeres, ALT) involviert zu sein und daher ALT assoziierte PML Körperchen (ALT associated PML bodies, APBs) genannt. Die Dynamik der Bildung von APBs wurde beobachtet. Im Hinblick auf die Unterschiede der Telomermobilität, der Länge der Telomersequenzwiederholungen und ihrer Interaktion mit den PML Körperchen erstellten wir ein Modell zur Beschreibung der Dynamik des ALT Wegs.

Translation of abstract (English)

The higher order chromatin organization and its dynamic properties are directly related to gene expression, replication, DNA repair and recombination. In this thesis the mobility of telomeres was studied with a human U2OS osteosarcoma cell line that had lacO operator repeats stably integrated at the telomeres of chromosomes 6, 11 and 12. The mobility of these three telomeres during interphase was monitored by fluorescence microscopy via bound proteins of LacI repressor fused to the autofluorescent GFP or mRFP1 domains. From measurements of the distance change between pairs of two tagged telomeres a confined diffusion model was derived that described the translocation of telomeres in the nucleus on the time scale from milliseconds to hours, using high performance live cell imaging. Three types of movements were identified: (i) Fast local movements on the (milli)second scale with a diffusion constant of Dms = 2·10-3 µm2 s-1 restricted to a region with radius rms ~ 80 nm, (ii) movement in the second/minute range with Dsec = 4·10-4 µm2 s-1 and rsec = 150 nm, and (iii) movements on the minute/hour time scale with Dmin = 2·10-5 µm2 s-1. For the later translocations average confinement radii of rmin = 0.3 ± 0.1 µm where determined, while a ~30% fraction of the telomeres showed a highly extended mobility with rmin = 0.8 ± 0.4 µm, suggesting that the majority of the telomere are anchored to a stable structure in the nucleus whereas a given fraction can move more freely. We could moreover show a correlation between the proportion of telomere having short repeat length and telomere displaying extended mobility, suggesting that an intact telomere is required for anchoring. In addition, the mobility of promyelocytic leukemia (PML) nuclear bodies relative to the telomeres was analyzed. The PML bodies formed complexes with the telomeres in the telomerase-negative U2OS cell line that have been reported previously to be involved in an alternative lengthening of telomeres (ALT) pathway: the ALT associated PML bodies (APBs). The dynamics of the formation of APBs was monitored. With regards to the differences in telomere mobility, the length of the telomere repeat sequences and their interaction with PML bodies we proposed a model to describe the dynamics of the ALT pathway.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Rippe, Karsten P. D.
Date of thesis defense: 26. July 2007
Date Deposited: 12. Dec 2007 09:40
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Telomerase, Allgemeine Zelle, Krebszelle, PML
Uncontrolled Keywords: Telomere , Telomerase-negative , PML body , APB , OsteosarkomTelomere , Telomerase-negative , PML body , APB , osteosarcoma
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