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Characterization of B-Cells Epitopes on HPV Capsid Proteins

Rizk, Raeda Z.

German Title: Characterisierung von B-zellen epitopen der HPV kapsid proteine

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Abstract

Human Papillomavirus (HPV) are considered as the major etiologic cause for a variety of benign and malignant epithelial lesions. The so-called high risk-HPV types are related to cervical cancer, while low-risk types are associated with benign mucosal lesions only. HPV types 16 and 18 are the most frequently found types in cervical cancers. Antibodies to HPV major capsid protein, L1, can develop in response to natural HPV infection as well as after vaccination. In contrast, antibodies to early, non-structural proteins, mainly E6 and E7 which are consistently expressed in HPVtransformed cells, have been found to be strongly associated with invasive carcinoma. Virus-like particles (VLP) which mimic morphologically and immunologically the native virions have been used so far as standard serological antigens. This PhD thesis had two main objectives, first to characterize the bacterially expressed, affinity-purified glutathione S-transferase fusion proteins (GST) as alternative antigens for serology in terms of displayed epitope repertoire, using a panel of 92 VLP-specific monoclonal antibodies (mAb) generated against 9 mucosal alpha papillomavirus types. The second objective was to analyze in details the natural as well as HPV vaccine-induced immune response in patients with cervical intraepithelial neoplasias (CIN II/III). Additionally, an antibody blocking assay based on Maltose binding protein (MBP)-fusions was established to analyze the typespecificity of HPV antibodies. It is shown here that GST-L1 fusion proteins display a broad variety of epitopes and thus are well suited for detection of human HPV antibodies. Cross-reactivity is associated with linear as well as conformational epitopes and can be intra- and/or interspecies specific and follows the phylogenetic relationships only loosely. Neutralizing epitopes are always conformational and mostly, but not always typespecific. The established MBP-16L1 allowed blocking the binding of mono-specific as well as cross-reactive antibodies to GST-16L1 but not that of specific antibodies to other HPV types. Vaccination of patients with cervical intraepithelial neoplasias with HPV16L1/E7 chimeric VLP induced strong 16L1 specific and weaker 16E7 specific responses as well as L1 neutralizing antibodies. The response was positively correlated with vaccine dose the immune status before vaccination. Vaccination-induced crossreactivity to both L1 and E7 was across species and the cross-reactive sera were non cross-neutralizing for distantly related HPV. Chimeric VLP vaccination also induced antibody responses to other HPV16 early proteins suggesting that these proteins were released from the lesions in response to vaccination. In conclusion, bacterially expressed GST fusion proteins are good candidates to be used as antigens in HPV serology and are also useful tools to define and characterize the complex patterns of conformational and linear cross-reactive epitopes.

Translation of abstract (German)

Humane Papillomviren (HPV) sind der wesentliche äthiologische Faktor für eine Reihe gutartiger und bösartiger epithelialer Läsionen. Die sogenannten Hoch-Risiko HPV Typen sind mit Gebärmutterhalskrebs assoziiert, Niedrig(Low)-Risiko Typen dagenegen nur mit gutartigen Schleimhautläsionen. Die HPV Typen 16 und 18 sind die häufigsten Typen in Gebärmutterhalskrebs. Antikörper gegen das Hauptkapsidprotein L1 können sich nach natürlicher Infektion aber auch nach Impfung entwickeln. Dagegen sind Antikörper gegen die frühen, Nichtstrukturproteine E6 und E7, die konsistent in HPV-transformierten Zellen exprimiert werden, stark assoziiert mit invasivem Krebs. Virus-ähnliche Partikel (VLP) ahmen morhologisch und immunologisch native Virionen nach und sind bisher als Standardantigen für HPV Serologie verwendet worden. Die beiden wesentlichen Ziele dieser Dissertation sind: (i) Bakteriell exprimierte, affinitätsgereinigte Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsproteine sollten bezüglich des Epitoperepertoires als alternative Serologieantigene charakterisiert werden unter Verwendung von 92 VLP-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die gegen 9 mukosale Alpha-Papillomavirus Typen entwickelt worden sind. (ii) Die natürliche wie die durch HPV-Impfung induzierte humorale Immunantwort sollte in Patientinnen mit Gebärmutterhalskrebs-Vorstufen (CIN II/III) detailliert beschrieben werden. Weiterhin wurde ein Antikörper-Blockierungstest basierend auf Fusionsproteinen mit Maltose-Bindungsprotein (MBP) entwickelt für die Analyse von typspezifischen HPV-Antikörpern. Hier wird gezeigt, dass GST-L1 Fusionsproteine eine breite Epitope-Palette präsentieren und so gut geignet sind humane HPV-Antikörper zu bestimmen. Kreuzreaktivität ist assoziiert mit linearen und konformationellen Epitopen, sie kann intra und/oder interspezies spezifisch sein und folgt nur wenig den phylogenetischen Verwandtschaften. Neutralisierende Epitopes sind immer konformationell und meistens, aber nicht immer typspezifisch. Mit dem Fusionsprotein MBP-16L1 konnte sowohl die Bindung von mono-spezifischen als auch kreuzreaktiven Antikörpern an GST-16L1 gehemmt werden aber nicht die von für andere HPV-Typen spefisiche Antikörpern an die entsprechenden Typen. In Seren von CIN II/III Patientinnen, die im Rahmen einer klinischen Studie mit HPV16L1/E7 chimären VLP geimpft worden waren, konnte die Induktion einer starken Antikörperantwort gegen 16L1 und schwächer gegen 16E7 und von neutralisierenden Antikörpern nachgewiesen werden. Die Immunantwort war positiv korreliert mit der Vakzinedosis und mit dem Immunstatus vor der Impfung. Durch die Impfung induzierte Kreuzreaktivität für L1 und E7 ging über Speziesgrenzen hinaus, aber Kreuzneutralisation mit entfernt verwandten Typen wurde nicht beobachtet. Impfung mit chimären VLP induzierte auch Antikörper gegen andere frühe HPVProteine, was darauf hinweist, dass diese Proteine aus den Läsionen freigesetzt wurden im Rahmen der immunologischen Impfantwort. Zusammengefaßt zeigt diese Dissertation, dass bakteriell exprimierte GSTFusionsproteine gut brauchbare Antigene sind für die HPV-Serologie und nützliche Werkzeuge zur Definition und Charakterisierung komplexer Muster konformationeller und linearer kreuz-reaktiver Epitope sind.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Gissmann, Prof. Dr. Lutz
Date of thesis defense: 10. December 2007
Date Deposited: 14. Dec 2007 15:15
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Gebärmutterhalskrebs, Glutathiontransferasen, Antikörper, Impfstoff, Humorale Immunität
Uncontrolled Keywords: Human Papillomavirus , Glutathione S-transferase , antibody , vaccine , cervical cancer
Additional Information: Teile in: Journal of General Virology
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