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Establishment of in vivo bioluminescence imaging models for tumor immunology

Miloud, Tewfik

German Title: Etablierung von Modellen bildgebender Verfahren der in vivo Biolumineszenz in der Tumorimmunologie

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Abstract

Die Überwachung des Tumorwachstums bzw. das Verfolgen von Zellen oder Pathogenen kann anhand des bildgebenden Verfahrens der in vivo Biolumineszenz (engl. in vivo bioluminscence imaging, Abk. BLI) erfolgen. Da die Methode des BLI noch in ihren Anfängen steht, konzentrierte sich diese Arbeit auf die Auswahl der optimalen Luciferase, um diese anschließend zur Etablierung eines in vivo BLI-Modells, das Studien der Tumorimmunologie dient, zu nützen. Außerdem sollte anhand von lumineszierenden Bakterien die Visualisierung von Tumoren untersucht werden. Zuerst wurde daher die meist verwendete Luciferase, die firefly luciferase (Fluc), mit der neu zur Verfügung stehenden grünen sowie roten Luciferase (CBGr99 und CBRed) des Schnellkäfers (engl. click beetle) verglichen. Zu diesem Zweck wurden equimolare Mengen der verschiedenen Proteine, CBGr99, CBRed bzw. Fluc, mit Hilfe von Zelltransfektion exprimiert. Um eine Equimolarität zu erzielen, wurde die jeweilige Luciferase mit eGFP (engl. enhanced green fluorescent protein) koexprimiert. Dies erfolgte durch Anwendung eines neuartigen bicistronischen 2A Systems, das in einer stöchiometrischen Koexpression der entsprechenden Proteine resultiert. Durch in vitro Experimente konnte die höchste absolute Photonen Ausbeute bei CBGr99 festgestellt werden. Injektion der Transfektanten an verschiedenen Stellen einer Maus zeigtendass die click beetle Luciferasen (CBLucs) besser gelisnet als Fluc fur die BLI sind. Der Vergleich zwischen den verwendeten CBLucs ergab, dass CBGr99 eine bessere oder ähnliche in vivo Sensitivität als CBRed aufwies, die jedoch vom Zeitpunkt der Analyse abhing. Die Analyse der mit CBGr99 transfizierten Zellen zeigte, dass die CBGr99 Expression mit der Zellanzahl korrelierte und somit für das Überwachen des Tumorwachstums in vivo verwendet werden konnte. Dafür wurde eine induzierbare transgene Mauslinie genereriert, die mit Hilfe des Cre/loxP Systems CBGr99 spezifisch in Leberzellen (ASC Linie) exprimiert. Diese transgene Mauslinie wurde mit der Linie AST gekreuzt, die nach Injektion eines Cre-recombinase kodierenden Adenoviruses autochthones Hepatokarzinom Wachstum entwickelt. Der Nachwuchs dieser Kreuzung, als ASCT benannt, ermöglichte das nicht-invasive Beobachten der Entwicklung des Hepatokarzinoms in lebenden Tieren durch in vivo BLI mittels der Expression von CBGr99. Das in dieser Arbeit entwickelte ASCT-Modell kann daher zur zeitlichen Überwachung des Tumorbeginns und -fortschreitens genützt und effektiv für Analysen zur Wirkug von Therapien verwendet werden. Ein weiterer Ansatz zur Visualisierung von Tumoren ist die Verwendung von Luciferaseexprimierenden Bakterien. Viele Bakterienstämme visieren nach intravenöser Injektion speziell Tumore an (engl. tumor targeting) und können dort überleben, während sie in Geweben vernichtet werden. BLI-Messungen zeigten, dass transgene Vibrio cholerae, die ein bakterielles Luciferase Gen (luxCDABE) exprimieren, Tumore in tumortragenden, immundefizienten Mäusen besiedeln („Tumor homing“). In dieser Arbeit konnte sowohl mit V. cholerae als auch mit Top10 E.coli ein effizientes „targeting“ von subkutanen Tumoren in immunkompetenten Mäusen, die eine Immunantwort gegen Bakterien erzeugen können, erzielt werden. Es konnte vorübergehend beobachtet werden, dass in verschiedenen Tumoren, wie z.B. AG104A, B16 sowie RMA, Tumorkolonisierung stattfand. Zusätzlich wurde die Fähigkeit der Bakterien, Tumore in verschiedenen spontanen Tumormodellen anzuvisieren, untersucht, z.B. in dem Hepatom-Modell (Albumin-Tag Mäuse), dem Insulinom-Modell (RIP.Tag-5 Mäuse) oder den Mammakarzinom-Modell (Her-2/neu Mäuse). Mit Hilfe des BLI konnte das bakterielle „homing“ in diese Tiermodellen untersucht werden und zeigte, dass die Effizienz des „tumor targeting“ geringer war als in subkutanen Tumoren. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass Bakterien als Vektoren für GM-CSF und IL-2 genützt werden können, um die Abwehr von Tumoren durch das Immunsystem zu verstärken. Damit eine Sekretion von GM-CSF und IL-2 mit Hilfe des Bakterienstammes Top10.lux im Tumorgewebe ermöglicht werden konnte, wurden die entsprechenden DNA-Sequenzen in ein Hemolysin A sekretorisches System kodierendes Plasmid inseriert. Die therapeutische Vakzinierung zeigte, dass Mäuse mit subkutanen Tumoren nach intravenöser Injektion mit Top10.lux.GM-CSF keine verstärkte Verzögerung des Tumorwachstums aufweisen, was im Gegensatz dazu bei Injektion mit Top10.lux beobachtet wird. Um die Infiltration von T-Zellen in das Tumorgewebe zu analysieren, wurde zusätzlich eine transgene Mauslinie (CAG-L2ACh) generiert, die CBGr99-positive Zellen liefert. Die CAGL2ACh Linie koexprimiert CBGr99 und ein rot fluoreszierendes Protein (mCherry) unter der Kontrolle eines ubiquitären Promoters. Anhand des BLI konnte in allen Geweben eine CBGr99 Expression festgestellt werden. Jede einzelne T-Zelle exprimierte mCherry und somit CBGr99. Daher zeichnet sich die CAG-L2ACh Linie als universeller Donor für „celltrafficking“ Studien mit Hilfe der BLI-Methode aus.

Translation of abstract (English)

In vivo bioluminescence imaging (BLI) technology allows to monitor tumor growth, to track cells or to follow pathogens. As BLI is still in its relative infancy, my work was focused on the choice of an optimal luciferase. Subsequently this optimal luciferase was used for establishment of vivo BLI models for tumor immunological studies. Additionally, visualization of tumors with luminescent bacteria was investigated. First, I have compared the most commonly used luciferase, namely firefly luciferase (Fluc), with the green and red luciferases (CBGr99 and CBRed) from the click beetle which recently became available. For this purpose, cell transfectants were generated expressing equimolar amounts of CBGr99, CBRed or Fluc. Equimolarity was achieved by coexpression of the luciferase with eGFP using a novel bicistronic 2A system, which results in stoichiometric coexpression of the respective proteins. In vitro the CBGr99 transfectant exhibited the highest total photon yield. By injecting the transfectants into mice at different locations, the click beetle luciferases (CBLucs) have been shown to be superior over Fluc for BLI. Moreover the comparison of the CBLucs showed that CBGr99 has either a superior or a similar sensitivity in vivo as compared to CBRed, depending on the time point of the analysis. In addition, the analysis of CBGr99 transfectants showed that CBGr99 expression correlates with cell number and can be used for monitoring of tumor growth in vivo. Therefore, using a Cre/loxP system an inducible transgenic mouse line that expresses specifically CBGr99 in the liver (ASC line) was generated. These mice were crossed with the AST line generated in the laboratory that has been shown to develop autochthonous hepatocarcinoma growth after injection of adenovirus encoding Cre recombinase. The resulting mice, named ASCT, permit non-invasive monitoring of hepatocarcinoma development in live animals via in vivo BLI of CBGr99 expression. The ASCT model permits longitudinal monitoring of tumor onsets, progression and may be used effectively for testing response to therapy. Another approach for visualization of tumors is to employ bacteria expressing luciferase. Several bacterial strains are known to specially target and survive in tumors after intravenous injection while they are cleared in other tissues. Tumor homing by Vibrio cholerae expressing a bacterial luciferase gene (luxCDABE) was visualized by BLI in immunodeficient deficient mice bearing tumors. I have shown that V.choleare as well as the Top10 E.coli strain could efficiently target subcutaneous tumors in immunocompetent mice which are able to mount an immune response against the bacteria. Moreover, the tumor colonization observed in various tumors such as AG104A, B16, and RMA was a transient phenomenon. In addition, the ability of bacteria to target tumors in different spontaneous tumor model such as a hepatoma model (Albumin-Tag mice), an insulinoma model (RIP.Tag-5 mice) and a mammary carcinoma model (Her-2/neu mice) was investigated. Vizualisation of bacterial homing by BLI showed that in these models the tumor targeting efficiency is lower than in subcutaneous tumors. In addition, I envisaged the usage of bacteria as delivery vector for GM-CSF and IL-2 in order to enhance elimination of tumors by the immune system. Secretion of GM-CSF and IL- 2 by Top10.lux bacteria was achieved by inserting their DNA sequences into a plasmid encoding the Hemolysin A secretory system allowing their secretion in the tumor site. In a therapeutic vaccination study, intravenous injection of Top10.lux.GM-CSF in mice bearing subcutaneous tumor did not enhance the delay on tumor growth which was observed with Top10.lux Finally, to monitor the infiltration of T cells in tumors, a transgenic mouse line (CAG-L2ACh line) that can serves as a source of CBGr99 positive cells was generated. In the CAG-L2ACh mouse line CBGr99 and a red fluorescent protein (mCherry) are co-expressed under the control of a ubiquitous promoter. By BLI, CBGr99 expression was visualized in all tissues. At the single cell level, 100% of the T cells expressed mCherry and thereby CBGr99. Therefore, CAG-L2ACh constitutes a universal donor for cell trafficking studies by BLI.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hämmerling, Professor Günter
Date of thesis defense: 23 November 2007
Date Deposited: 29 Feb 2008 12:05
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Biolumineszenz
Uncontrolled Keywords: in vivo Biolumineszenz , Luciferase , Tumormodell , Transgene Mäuse , bakterielle Tumortherapiein vivo bioluminescence imaging , luciferase , tumor model , transgenic mice , bacterial tumor therapy
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