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Characterization of the Substrate Specificity of the Dnmt2 Methyltransferase

Meusburger, Madeleine

German Title: Charakterisierung der Substratspezifität der Dnmt2 Methyltransferase

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Abstract

Summary The modification of cytosine to 5-methyl-cytosine within DNA plays an important role in epigenetic processes. In eukaryotes, the methylation reaction is catalyzed by the family of DNA methyltransferases (Dnmts). The Dnmt2 protein is the most conserved and most widely distributed member of the Dnmt family, however, its catalytic function has been an enigma. Structural analysis predicts the enzyme to be a bona fide DNA methyltransferase, though it exhibits only marginal DNA methylating activity in vitro. Recently, however, Dnmt2 was discovered to be a tRNA methyltransferase, catalyzing the formation of 5-methyl-cytosine at position 38 of tRNAAsp within the anticodon stem-loop. This work contributed to the further characterization of the enzyme in the model organism Drosophila melanogaster. A null mutant was characterized and used for further DNA methylation analysis in comparison to Dnmt2-containing wildtype flies. Dnmt2-dependent DNA methylation was discovered at one defined locus in the fly genome: within the 3´-region of the mini-white marker gene of a mobile element which had inserted into the retrotransposon invader 4. Further experiments could show that unmodified, in vitro transcribed tRNAs are targets of the Dnmt2 enzyme derived from fly and human, and that other modifications are not a prerequisite for Dnmt2 target recognition. Besides tRNAAsp, tRNAVal was identified as a new target of Dnmt2 in vitro and in vivo. The optimization and versatile application of the DNAzyme technique allowed the quantification of the methylation signal. Furthermore, non-C38 containing tRNAs from various organisms were also found to be methylated by Dnmt2 in vitro. The new methylation site could be mapped to C40 in tRNAPhe from Saccharomyces cerevisiae, and to C40 and C42 in tRNALys from Drosophila melanogaster. The analysis of several catalytic Dnmt2 mutants of human Dnmt2 in combination with various tRNA substrates revealed two different catalytic mechanisms.

Translation of abstract (German)

Zusammenfassung Die Methylierung von Cytosin zu 5-methyl-Cytosin in DNA spielt eine wichtige Rolle in zahlreichen epigenetischen Regulationsprozessen. In Eukaryoten wird die Methylierungsreaktion von der Familie der DNA-Methyltransferasen (Dnmts) katalysiert. Das Dnmt2-Protein ist das am höchsten konservierte und das am weitesten verbreitete Mitglied dieser Enzymfamilie; jedoch blieb seine katalytische Funktion lange rätselhaft. Aufgrund von Strukturanalysen wurde die Vorhersage getroffen, dass Dnmt2 eine bona fide DNA-Methyltransferase sein sollte; jedoch konnte nur eine sehr geringe katalytische Aktivität von Dnmt2 in einem in vitro Methylierungsexperiment nachgewiesen werden. Kürzlich wurde allerdings entdeckt, dass Dnmt2 eine tRNA-Methyltransferase ist, welche die Position C38 in dem Anticodon-Loop von tRNAAsp methyliert. Die vorliegende Arbeit trug zu der weiteren Charakterisierung des Enzyms in dem Modellorganismus Drosophila melanogaster bei. Eine Dnmt2-Nullmutante wurde charakterisiert und in DNA-Methylierungsanalysen mit Wildtyp-Fliegen verglichen. Dnmt2-abhängige DNA-Methylierung wurde an einer definierten Stelle im Fliegengenom gefunden: in der 3´-Region des mini-white-Markergens eines mobilen Elements, welches in das Retrotransposon Invader 4 gesprungen war. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass in vitro transkribierte, nicht modifizierte tRNAs als Substrate von Dnmt2 aus Mensch und Fliege akzeptiert werden, und dass demnach andere Modifikationen keine Voraussetzung für die Substraterkennung durch Dnmt2 darstellen. Neben tRNAAsp wurde tRNAVal als neues in vivo und in vitro Substrat von Drosophila Dnmt2 identifiziert. Die Optimierung und die vielseitige Anwendung der DNAzym-Methode ermöglichte die Quantifizierung des Methylierungssignals. Darüber hinaus konnten mehrere nicht-C38-enthaltende tRNAs aus verschiedenen Organismen von Dnmt2 in vitro methyliert werden. Als neue Methylierungsstellen wurden C40 in tRNAPhe aus Saccharomyces cerevisiae und C40 und C42 in tRNALys aus Drosophila melanogaster identifiziert. Die Analyse mehrerer katalytischer Mutanten von humanem Dnmt2 unter Verwendung verschiedener tRNA-Substrate zeigte zwei unterschiedliche katalytische Mechanismen auf.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Harald (Prof. Dr.), Herrmann-Lerdon
Date of thesis defense: 1 September 2008
Date Deposited: 04 Sep 2008 14:02
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: DNS-Methyltransferase, Epigenetik, Transfer-RNS
Uncontrolled Keywords: Transfer-RNS-Methyltransferase , Dnmt2Dnmt2 , DNA Methyltransferase , tRNA Methyltransferase
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