Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

Analysis of enhanced retinoblastoma protein (pRb) degradation in HPV-positive cells after histone deacetylase inhibition

Karaduman, Handan

German Title: Analyse der Retinoblastoma Protein Degradation in HPV-positiven Zellen nach Histonedeacetylase-Inhibitor Behandlung

[img]
Preview
PDF, English
Download (1687Kb) | Terms of use

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the persistent URL or the URN below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

ABSTRACT Human papillomaviruses have been identified as the major aetiological factor in cervical carcinogenesis. Constitutive expression of the high-risk HPV E6 and E7 oncoproteins are important for the malignant transformation during the course of infection. In particular, E6 binds to p53 and E7 binds to pRb to mediate their proteasomal degradation which is a crucial step for the HPV procured cell cycle progression. In order to analyse the biological outcomes in context of the HPV transformed cells, anti-tumour agents known as HDAC inhibitors (HDACi) were used. In the work presented here, the interest was precisely focused to analyse the role of E7 in tumour suppressor protein pRb degradation following HDAC inhibition. Initial observation in HPV18 positive cervical carcinoma cells HeLa and SW756, demonstrated an E7 dependent degradation of pRb upon SB and TSA. This observation was confirmed further by using the HPV negative cervical cancer cells C33-A and HT-3. Furthermore, to prove whether tumorigenic phenotype was a critical determinant, the effect of HDACi on the Stanbridge cell system (non-tumorigenic 444 and the tumorigenic CGL-3 cells) was analysed. No discernible difference in pRb degradation was observed between the different cell segregates. Moreover the use of the individual E6 and E7 immortalised keratinocytes significantly demonstrate the functional link between E7 and pRb degradation. The pRb protein is able to repress the transcription of the cell cycle regulatory proteins (cyclin E, DNA polymerase-α, dihydrofolate reductase (DHFR) etc.), involved in the G1 to S phase by binding the transcription factor E2F and recruiting the HDAC1 molecules to their promoters. To investigate whether pRb degradation was accompanied with the upregulation of the key molecules involved in G1 to S transition the protein level of cyclin E was examined. Western Blot analysis was performed in HeLa, 444, CGL3 cells and in E6- and E7- immortalised keratinocytes. Essentially, cyclin E upregulation was observed while the E2F protein level was unchanged in HPV 18 containing cells and in E7 immortalised keratinocytes. These results demonstrate that the presence of E7 oncoprotein is a prerequisite for pRb degradation upon HDAC inhibition. In order to establish more functional link between E7 and pRb degradation upon HDAC inhibition, two experimental approaches were used. At first, the E7 oncoprotein was knocked down by using siRNA in the HeLa cells. Secondly, E7 oncoprotein was introduced in TE-671 which are HPV negative, but pRb positive cells. In both systems, we observed that E7 has an indispensable role on pRb degradation upon HDACi treatment. In order to dissect the role of the individual oncoprotein in HDACi induced pRb degradation, E6 and E7 immortalised keratinocytes were used. Treatment of the cells with proteasome-inhibitor MG132 (2 µM, 16 h) shows that the degradation of pRb occurs via 26S proteasome pathway in E7 immortalised keratinocytes. In order to accentuate the importance of the direct interaction between E7 and pRb, a serine protease inhibitor TLCK was used. In particular, modification of the E7 protein by using the TLCK, rescued pRb from HDACi induced degradation. Furthermore, cyclin E which is negatively regulated by pRb was downregulated again. These results emphasized the importance of the physical association between E7 and pRb and the crucial role of the LXCXE motif of E7 protein. In addition, co-treatment of SB with TLCK interferes with the SB mediated G1 arrest, which was shown by the cell cycle distribution analysis and downregulation of the cyclin-dependent kinase inibitor p21. Furthermore, p21 is activated in response of HDACi which is responsible for the inactivation of the cyclin/CDK complexes in G1 phase. In order to analyse the HDACi induced apoptosis in the context of HPV, Hela cells were treated with SB and TSA and apoptotic cells were analysed by flow cytometry. Consistently, HeLa cells expressed apoptotic markers within at 24 hours while the HPV negative cervical cancer cells C33-A were not sensitive for apoptosis in response to HDACi treatment. Furthermore this confirmed the crucial role of the E7-pRb interaction for the HDACi mediated apoptosis. HDACi induced cell death mainly by activating the intrinsic apoptotic pathway. In order to address the target apoptotic gene expression in the HPV context and individual oncogenes, Hela cells and the E6- and E7-immortalised keratinocytes were used. After treatment with SB, RT-PCR (real-time) analyses were performed for p73 expression. The E2F mediated apoptotic protein p73 was upregulated in response to HDACi treatment. This effect was reversed by TLCK treatment in HeLa as well as in E7 immortalised keratinocytes. Thus p73 transcription was reduced in HeLa cells as well as in E7 immortalised keratinocytes. These data confirm the presence of HPV E7, which sensitizes the cells for SB mediated apoptosis, and which can be reversible by posttranslational modification of the HPV E7. Finally the HDAC inhibitor mediated apoptosis can be inhibited by TLCK. Subsequently this study bears new future aspects in understanding the role of serine proteases during HDAC inhibition.

Translation of abstract (German)

ZUSAMMENFASSUNG In der Ätiologie der Zervixkarzinome spielt die Infektion mit „high-risk“ Typen humaner Papillomviren eine entscheidende Rolle (zur Hausen, 1996). Die konstitutive Expression der viralen Onkogene E6 und E7 und deren Interaktionen mit Regulatoren des Zellzyklus sind wichtig bei der malignen Transformation der Wirtszellen. Insbesondere die proteasomale Degradation des Tumorsuppressorproteins p53 durch E6 und die Degradation von pRb durch Interaktion mit E7, zeichnen sich als eine wichtige Stufe im Rahmen der HPV vermittelten Deregulation des Zellzykluses dar. Diese Gruppe von antitumor Agenzien zeichnen sich durch potenziellen Inhibierung der Zellzyklus- Progression, Differenzierung und/oder von Apoptose in Tumorzellen aus, während normale humane Zellen eher moderat beeinflusst werden. In der vorliegenden Arbeit wurde im besonderem die Rolle von HPV E7 bei der HDAC inhibitoren induzierten Degradation des Tumorsuppressor Proteins pRb untersucht. Die ersten Ergebnisse mit den HPV18 positiven HeLa und SW756 Zellen zeigten, dass die Präsenz von HPVE7 eine Rolle bei der HDAC-Inhibitoren induzierten pRb Degradation spielt. In weiteren Untersuchungen zeigten die HPV negativen Zervixkarzinom Zellen C33-A und HT-3 keine pRb Degradation. Des weiterem wurde festgestellt, dass der tumorigene Phänotype keine Rolle in diesem Kontext spielt, indem das Stanbridge System verwendet wurde, welches aus der Fusion von HeLa und humanem Fibroblasten, den 444 und deren tumorgene Subklonen CGL-3 besteht. Im besonderen zeigte die Behandlung von Keratinozyten, welche individuell mit E6 und mit E7 Onkogenen transfiziert worden sind, dass nur in E7 immortalisierten Keratinozyten eine pRb Degradation Zustande kam, während in E6 Keratinozyten nur hypophosphoryliertes pRb zu beobachten war. Das pRb ist unter anderem auch zuständig für die transkriptionelle Regulation der regulatorischen Proteine der G1 Phase durch direkte Bindung an den E2F Transkriptionsfaktor. Im Rahmen der HDACi Behandlung war es daher wichtig zu untersuchen, ob die von pRb negativ regulierten Proteine wie Cyclin E hochreguliert werden konnten, wenn pRb degradiert war. Western blot Analysen zeigten, dass dies in HPV 18 positiven und E7 immortalisierten Keratinozyten der Fall war, während die Proteinmenge von E2F unverändert blieb. Dies bestätigte des weiteren, dass die E7 Präsenz eine Vorraussetzung für die HDAC inhibitoren vermittelte pRb Degradation ist. Weiterhin wurde durch Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 bewiesen, dass die Degradation von pRb bei der HDACi- Behandlung zum größten Teil über das 26S Proteasom System durchgeführt wird und das E7- Protein in diesem Zusammenhang eine direkte Funktion übernimmt. Um unsere Hypothese zu bekräftigen, wurden zwei Ansätze verfolgt. Zuerst wurden HeLa Zellen mit einer siRNA die gegen HPV18E7 gerichtet ist transfiziert. Obwohl dadurch keine bemerkenswerte Hochregulierung von pRb beobachtet wurde, konnte man feststellen dass eine hypophosphorylierte pRb Bande nach SB Behandlung entstand. Als nächstes wurde in HPV negativen aber pRb positiven Rhabdomyosarcoma Zellen (TE-671), HPV E7 eingeführt. Die Behandlung mit SB zeigte dass nach Einführen des E7 Onkoproteins eine gesteigerte Degradation von pRb zu beobachten war. Um zu beweisen dass die direkte Interaktion zwischen E7 und pRb eine entscheidende Rolle für die beobachtete HDACi vermittelte Degradation ist, wurden HeLa Zellen zusammen mit dem Serineprotease Inhibitor (TLCK) mit SB behandelt. Die Ergebnisse zeigten, dass TLCK die SB vermittelte Degradation zum größten Teil aufheben konnte und das von pRb negativ regulierte Cyclin E abnahm. Zudem konnte auch gezeigt werden, dass TLCK mit dem von SB verursachten G1 Arrest interferieren kann, der ab 16 Stunden Behandlung zustande kam. Diese Beobachtung konnte durch Western Blot Analyse von p21 bestätigt werden, die eine Abnahme von p21 unter TLCK Behandlung zeigten. Der HDACi vermittelte G1 Arrest wird im wesentlichen dadurch verursacht, dass p21 auf der transkriptionellen Ebene aktiviert wird. Längere Behandlungen mit HDACi, beginnend ab 24 Stunden zeigten einen apoptotischen Phänotyp in HeLa Zellen, während die HPV negativen Zervixkarzinom Zellen C33-A sich nicht apoptotisch verhielten. Das bekräftigte die Voraussage, dass die Präsenz von HPV die Zellen zu HDACi induzierter Apoptose begünstigen. Insbesondere hebt dieses die wichtige Interaktion zwischen pRb und E7 hervor. Die von HDAC Inhibitoren verursachte Apoptose wird in den meisten Fällen durch den mitochondrialen Weg vermittelt. Um auf der molekularen Ebene festzustellen welche Gene die diesen Mechanismus einleiten können, auf Grund der aufgehobenen pRb Repression aktiviert werden, wurde die transkriptionelle Untersuchung des proapoptotischen proteins p73 nach Behandlung mit HDACi analysiert. Hierfür wurden HeLa und die mit den Onkogenen E6 und E7 immortalisierten Keratinozyten eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass p73 in HeLa und in E7 Keratinozyten induziert wurde, während in E6 Keratinozyten eine moderate Hochregulierung zu sehen war. Interessanterweise wurde diese Transkription nach der Inkubation zusammnen mit TLCK reduziert. Diese Daten belegen, dass E7 die HPV positiven Zellen für HDAC Inhibitor vermittelte Apoptose sensibilisieren kann, welches durch posttranslationale Modifikation von E7 aufgehoben wird. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse dass die Serinproteasen eine wichtige Rolle bei HDAC Inhibitor vermittelten Effekten haben können.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kübler, Privat Do Dieter
Date of thesis defense: 2. September 2008
Date Deposited: 26. Sep 2008 07:07
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Zellzyklus, Gebärmutterhalskrebs, Histon-Deacetylase, Papillomaviren
Uncontrolled Keywords: Retinoblastoma Protein , E7 protein , HPV , Natrium Butyrate , Trichostatin ApRb , HPVE7 , sodium butyrate , HDAC inhibitor , cell cycle , Apoptose
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoLogo der Open-Archives-Initiative