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A transgenic strategy to define SLCO1C1-expressingstructures during brain development

Lang, Ming-Fei

German Title: Eine transgene Strategie um SLCO1C1-exprimierende Strukturen im sich entwickelnden Gehirn zu identifizieren

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Abstract

Schilddrüsenhormone sind wichtig für die Entwicklung des Gehirns. Ein zu geringer Thyroxinspiegel der Mutter ist die Hauptursache für Fehlbildungen des fötalen Gehirns. Bei Erwachsenen gelangt das Hormon Thyroxin über den Thyroxintransporter SLCO1C1, der auf Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke und Epithelzellen des Plexus choroideus exprimiert wird, ins Gehirn. SLCO1C1 ist bisher der einzig bekannte Transporter, der die Aufnahme von Thyroxin ins adulte Gehirn vermittelt. Das Expressionsprofil von SLCO1C1 während der Entwicklung war bisher allerdings unbekannt. Um die Expression von SLCO1C1 während der Entwicklung zu untersuchen, wurde ein transgener Ansatz mittels BAC Rekombination gewählt. Die Nukleotidsequenz der Cre Rekombinase (konstitutiv) oder der Cre Rekombinase, die an die mutierte Ligandenbindungsstelle des Östrogenrezeptors fusioniert wurde (induzierbar), wurde auf dem BAC mittels homologer Rekombination in den Genlokus von Slco1c1 eingefügt. Die modifizierten BACS wurden anschließend in den Pronukleus von Mäusen injiziert um transgene Tiere zu generieren, welche die Cre Rekombinase im Slco1c1 Locus entweder konstitutiv oder induzierbar exprimieren. In diesen transgenen Mäusen konnten sowohl die Transkripte der Cre also auch von Slco1c1 exklusiv im Gehirn mittels RT-PCR nachgewiesen werden. In der Immunhistochemie wiesen Mäuse aus der konstitutiven Linie Cre Expression in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke und im Plexus choroideus auf. Dieses Expressionsmuster wurde durch die Verpaarung der Cre-Linien mit einer Reportermauslinie bestätigt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Cre während der Entwicklung in Neuronen vieler Hirnregionen (wie in der kortikalen Ebene 2/3, dem Hippokampus und dem Bulbus olfactorius) aktiv ist. Cre-vermittelte Rekombination wurde in den neurogenen Zonen an Tag E14 und E18 nachgewiesen, während keine Cre Aktivität in adulten Neuronen vorhanden war. In der induzierbaren Cre Linie konnte nach Tamoxifen-Injektion keine Cre Aktivität in adulten Neuronen gefunden werden passend zu einer embryonalen transkriptionellen Aktivität des Slco1c1-Locus in neuronalen Progenitorzellen. Die neuronale Expression von Cre während der Entwicklung lässt vermuten, dass Thyroxin eine Rolle in der Expression von SLCO1C1 spielt. Hypothyroxinämie, die durch die Gabe von Propylthiouracil (PTU) induziert wurde, reduzierte die Anzahl der Neuronen in den kortikalen Schichten 2/3, die von SLCO1C1 exprimierenden Progenitorzellen abstammen. Weiterhin wurde die Rolle von SLCO1C1 in der adulten Neurogenese untersucht. Durch RT-PCR konnten Slco1c1 Transkripte in kultivierten neuronalen Stammzellen (NSC) nachgewiesen werden. In adulten Slco1c1-Cre Tieren waren Cre und der neuronale Stammzellmarker GFAP in der Subventrikulärzone kolokalisiert. Sowohl unter Kontrollbedingungen als auch nach einer zerebralen Ischämie konnte gezeigt werden, dass die Lokalisation von Cre mit dem Marker für unreife Neuronen Dcx nahe der Subventrikulärzone übereinstimmt . Zusammenfassend wurde die Slco1c1-Cre transgene Mauslinie generiert und genutzt, um Areale des Gehirns zu identifizieren, in denen Slco1c1 während der Entwicklung exprimiert wird. SLCO1C1 ist möglicherweise an den Effekten von Schilddrüsenhormonen bei der Neurogenese beteiligt.

Translation of abstract (English)

Thyroid hormones (THs) are important for brain development. Maternal hypothyroxinemia, low maternal thyroxine levels, is a major cause of defects in fetal brain development. In adults, thyroxine enters brain through the thyroxine transporter SLCO1C1, which is expressed in endothelial cells of the blood-brain barrier (BBB) and in epithelial cells of the choroid plexus. Till now, SLCO1C1 is the only known transporter that mediates the entry of thyroxine into the adult brain. However, the expression pattern of SLCO1C1 during development was unknown. To characterize the expression of SLCO1C1 in development, a transgenic approach was employed by bacterial artificial chromosome (BAC) recombineering. Sequences of Cre recombinase (constitutive) or Cre recombinase fused to a mutated estrogen receptor ligand binding domain (inducible) were inserted into the Slco1c1 locus on a BAC by homologous recombination. The modified BACs were subsequently injected into pronuclei to generate mice carrying the Slco1c1-driven Cre, which is expressed either constitutively or in an inducible manner. In the transgenic mice, both Cre and Slco1c1 transcripts could be detected by RT-PCR only in the brain. Mice from the constitutive line showed Cre expression in BBB and choroid plexus according to immunohistochemistry. This localization was confirmed by crossing mice with a reporter mouse line. In addition, neurons in many brain regions (such as cortical layer 2/3, the hippocampus and olfactory bulbs) expressed Cre during brain development, since Cre activity could not be detected in adult neurons but Cre-mediated recombination was found in the neurogenic zones at E14 and E18. In the inducible line, no Cre activity in the adult neurons was found, which also confirmed an early neuronal expression of Slco1c1-Cre. The neuronal expression of Cre in development indicates a role of thyroxine in the SLCO1C1-expressing neurons. Hypothyroxinemia induced by propyl-thio-uracil (PTU) decreased the number of cortical layer 2/3 SLCO1C1-expressing neurons. Furthermore, a role of SLCO1C1 in adult neurogenesis was also investigated. By RT-PCR, Slco1c1 transcripts could be detected in cultured neural stem cells (NSC). In adults, Cre colocalized with a neural stem cell marker, GFAP, in the subventricular zone. Both under normal conditions and in a stroke model, Cre was found to colocalize with an immature neuronal marker, Dcx, near the subventricular zone. In conclusion, Slco1c1-Cre transgenic mouse lines were generated and were used to identify Slco1c1-expressing brain structures during development. SLCO1C1 may be involved in the effects of thyroid hormones on neurogenesis.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schütz, Prof. Dr. Günther
Date of thesis defense: 29. September 2008
Date Deposited: 01. Oct 2008 14:11
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > Pharmakologisches Institut
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Schilddrüsenhormon, Hirnforschung
Uncontrolled Keywords: SLCO1C1, transgenSLCO1C1, transgenic
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