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Molecular mechanisms leading to the inhibition of erythroid differentiation by the proinflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha

Buck, Isabelle

German Title: Molekulare Mechanismen die zur Inhibition der erythroiden Differenzierung durch den entzündungsfördernden Tumornekrosefaktor alpha führen

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Abstract

Erythropoiesis is considered as a multistep and tightly regulated process under the control of a series of cytokines including erythropoietin (Epo). Epo activates specific signaling pathways and key transcription factors such as GATA-1, in order to ensure erythroid differentiation. Dysregulation leads to a decreased number of red blood cells, a hemoglobin deficiency, thus a limited oxygen-carrying capacity in the blood.Anemia represents a frequent complication in various diseases such as cancer or inflammation related disease. Tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) was described to be involved in the pathogenesis of inflammation and cancer related anemia, which reduces both quality of life and prognosis in patients. Blood transfusions and erythroid stimulating agents (ESAs) including human recombinant Epo (rhuEpo) are currently used as efficient treatments. However, the recently described conflicting effects of ESAs in distinct studies require further investigations on the molecular mechanisms involved in TNFalpha-caused anemia. The aim of this study was to reveal the molecular mechanisms linked to the inhibition of erythroid differentiation by the proinflammatory cytokine TNFalpha. In order to achieve this goal, we used three different hematopoietic cell lines (K562, HEL, and TF-1) as well as purified CD34+ hematopoietic progenitor cells from umbilical cord blood. For K562 and HEL cells, distinct chemical compounds such as Aclacynomicin (Acla), Doxorubicin (Dox), or Hemin (He) were used to induce erythroid differentiation, whereas TF-1 and CD34+ cells were treated with Epo. Results showed an inhibitory effect of TNFalpha on hemoglobin synthesis in the different cellular models, independently of the inducer used. This effect was correlated with a decrease of the major erythroid transcription factor GATA-1 and its coactivator Friend of GATA-1 (FOG-1). We further demonstrated that the reduction of the GATA-1/FOG-1 complex was partly due to a proteasome-dependent degradation of the interaction partners. Moreover, an unsettling of the complementary expression profiles of GATA-1 and GATA-2 in the three cell lines tested was observed, which is in disfavor of final erythroid differentiation. The observed abolishment of the acetylation status of GATA-1 by TNFalpha in He-induced K562 cells even suggested an impact of the cytokine on GATA-1 transcriptional activity. As assessed by transfection experiments, TNFalpha had also an inhibitory effect on GATA-1 transactivation activity, independently of the inducer used. Then we analyzed the expression of specific marker genes partly known as GATA-1 target genes. Results revealed a decrease in Epo receptor (EpoR), alpha- and gamma-globin, erythroid-associated factor (ERAF), hydroxymethylbilane synthetase (HMBS), and glycophorin A (GPA) expressions after TNFalpha treatment. Furthermore, we showed that p38 is involved in the TNFalpha-mediated inhibition of Epo-triggered erythroid differentiation, as the p38 inhibitor SB203580 reverses the inhibition of hemoglobin production, gamma-globin gene and GATA-1 expression. These data contribute to a better understanding of the molecular mechanisms involved in cytokine-dependent anemia both by revealing modulations of key erythroid transcription factors as well as potential diagnostic markers. Overall this study gives first hints of the key players involved in TNFalpha-mediated inhibition of erythroid differentiation, which can be seen as foundation for future investigations.

Translation of abstract (German)

Die Erythropoese stellt einen mehrstufigen, streng regulierten Prozess dar, der durch Erythropoetin (Epo) und andere Zytokine gesteuert wird. Epo aktiviert bestimmte Signaltransduktionswege und Transkriptionsfaktoren (TF), wie z.B. TF GATA-1, der eine entscheidende Rolle als Regulator der Erythrozytendifferenzierung spielt. Eine Deregulierung dieser Schlusselfaktoren kann zur Reduzierung der roten Blutkörperchen führen, was mit einer Hämoglobindefizienz und somit einer verminderten Sauerstoff-Transportkapazität im Blut einhergeht. Die Anämie stellt eine häufig auftretende Komplikation bei Krebs- oder Entzündungserkrankungen dar. Der Tumornekrosefaktor alfa (TNFalpha) ist ein Hauptmediator von Entzündungskrankheiten und wurde in der Pathogenese von diversen entzündungs- sowie bei krebsbedingten Anämien beschrieben, wodurch sowohl die Lebensqualität als auch die Prognose des Krankheitsverlaufes beeinträchtigt wird. Vor der Verwendung von Erythropoese stimulierenden Agenzien (ESAs) waren Bluttransfusionen die einzige verfügbare Therapie. Die kürzlich diskutierten, z.T. widersprüchlichen Therapieergebnisse der ESAs machen die Erforschung der molekularen Mechanismen, die mit der genannten Anämie assoziiert sind, notwendiger denn je. Ziel dieser Studie ist es, molekulare Mechanismen, zu entschlüsseln, die der Hemmung der Erythropoese durch das proinflammatorische Zytokin TNFalpha zugrunde liegen. Hierfür wurden verschiedene zelluläre Modelle verwendet. Hämatopoetische Zelllinien (K562, HEL) wurden durch chemische Verbindungen wie Aclacynomicin (Acla), Doxorubicin (Dox) oder Hemin (He) zur Erythropoese angeregt, wohingegen TF-1 Zellen oder aus Nabelschnurblut isolierte, hämatopoetische Vorläuferzellen (CD34+) mit Epo behandelt wurden. Nach Zugabe von TNFalpha wurde dessen inhibitorischer Effekt auf die Hämoglobinsynthese in allen Modellen sichtbar. Dieser Effekt ging in allen untersuchten Zelllinien mit einer Reduktion der GATA-1- und FOG-1-Proteine einher. Der Rückgang des GATA-1/FOG-1 Interaktionskomplexes nach TNFalpha-Zugabe ließ sich auf einen Proteasom-abhängigen Abbau der Interaktionspartner zurückführen. Ferner wurde eine Veränderung der komplementären Expressionsprofile von GATA-1 und GATA-2 beobachtet, was dem Differenzierungsprozess entgegensteht. Eine Veränderung des Acetylierungsstatus von GATA-1 in He-behandelten K562 Zellen nach TNFalpha Zugabe ließ einen Einfluss des Zytokins auf die transkriptionelle Aktivierung von GATA-1 vermuten. Diese Theorie unterstützend zeigte TNFalpha, unabhängig vom benutzten Induktor, einen inhibitorischen Effekt auf die transkriptionelle Aktivität von GATA-1. Eine erythroidbezogene Markergen-Analyse zeigte nach TNFalpha-Zugabe eine Expressionsreduzierung folgender Gene: Erythropoetin Rezeptor, alpha- und gamma-Globin, Erythroid-assoziierter Faktor, Hydroxymethylbilan Synthetase und Glykophorin A. Gleichzeitig konnte in TF-1 Zellen mit Hilfe eines p38-Inhibitors die Beteiligung von p38 an der TNFalpha-getriggerten Hemmung auf verschiedenen Ebenen (Hämoglobinsynthese, GATA-1- und gamma-Globin-Proteinexpression) gezeigt werden. Die Ergebnisse führen zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Zytokin-abhängigen Anämie zugrunde liegen. So wurden Veränderungen im Transkriptionsfaktorprofil, sowie in der Expression verschiedener potentieller diagnostischer Markergene festgestellt. Insgesamt enthüllt diese Studie erste vielversprechende Erkenntnisse über verschiedene Schlüsselelemente, die in der Hemmung der Erythropoese durch TNFalpha eine entscheidende Rolle spielen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Buselmaier, Prof. Dr. Werner
Date of thesis defense: 10. September 2008
Date Deposited: 04. Nov 2008 15:58
Date: 2008
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut für Humangenetik
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Entzündung, Cytokine, Anämie, Hämatopoese, Krebsforschung, Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>
Uncontrolled Keywords: Tumor necrosis factor alpha , inflammation , cancer , anemia , transcription factors
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