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A closer look at Schizosaccharomyces pombe interphase microtubule arrays

Roque, Hélio

German Title: Einen genaueren Blick auf Schizosaccharomyces pombe Interphase Mikrotubuli Zusammenschlüsse

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Abstract

Determination of cell shape is an essential mechanism for cells like neurons, epithelial and fungal. In general, these cells are able to control their shape by positioning mechanisms that regulate cell growth and cell polarity. One key element for such a process is the microtubule cytoskeleton, which is organized into higher order assemblies in polarized cells. Therefore, an important question is to understand how these assemblies are established and maintained during interphase. We addressed this question by making use of mutants of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe to study the organization of Interphase Microtubule Assemblies in high ultra-structural detail, using a new emerging technology – electron tomography. Mto1p, Ase1p and Klp2p are key Microtubule Associated Proteins required for the organization of microtubules into interphase microtubule arrays (IMAs). We reconstructed high resolution 3D volumes of mto1, ase1 and klp2 deletion strains (and all double mutants) in order to study the formation and organization of IMAs. We show that all mutants lacking ase1 maintain microtubule overlap regions but with altered inter-microtubule spacing. In addition, in ase1Δ klp2Δ cells the microtubules appear to have lost their connection to the spindle pole body. Interphase microtubule arrays in klp2Δ cells are mostly composed of only two microtubules instead of 2 to 9 in wild type. A similar phenotype is found in cells lacking Mto1p protein and cells lacking Mto1p and Klp2p proteins. Cells lacking Ase1p and Mto1p proteins form an interphase microtubule arrays composed of three microtubules, which extend the whole cell length. Both mto1Δ and mto1Δ ase1Δ cells present intra-nuclear microtubules but with a different organization. Finally, we show that impaired interphase microtubule arrays affect the mitochondria network structure in these deletion strains. The electron tomography analysis of the Ase1p deletion strains suggest the existence of other putative proteins involved in the microtubule bundling process. We show that most microtubules ends in mto1Δ cells have open end structures allowing microtubules to show treadmilling behavior. Furthermore, cells lacking Mto1p and/or Klp2 show IMAs with only two MTs, suggesting a role of Klp2p in microtubule nucleation. We propose a mechanistic model to tentatively explain the formation of stable IMAs. Finally we discussed the effects of defective IMAs at the cellular level by showing how the mitochondria network is affected in the deletion mutants compared with wild type cells.

Translation of abstract (German)

Die Bestimmung der Zellform ist ein entscheidender Mechanismus für viele Zellen wie zum Beispiel Neurone, Epithel und Pilzzellen. Im Allgemeinen sind diese Zellen in der Lage, ihre Form zu kontrollieren, indem sie die Position der Mechanismen von Zellwachstum und Zellpolarität steuern. Hierbei spielt das Microtubuli Zytoskelett eine wichtige Rolle. Dieses ist in polarisierten Zellen in Zusammenschlüsse höherer Ordung organisiert. Es ist deshalb von zentraler Bedeutung zu verstehen, wie diese Zusammenschlüsse während der Interphase gebildet und aufrechterhalten werden. Wir haben uns mit dieser Frage befasst, indem wir die “Interphase Mikrotubuli Zusammenschlüsse” (IMAs) in verschiedenen Mutanten der Spalt-Hefe, Schizosaccharomyces pombe genauer untersuchten. Hierbei verwendeten wir eine der modernsten Technologien für die Darstellung ultrastruktureller Details, die Elektronentomographie. Mto1p, Ase1p und Klp2p sind wichtige “Microtubuli Assoziierte Proteine” (MAPs) welche für den Zusammenschluss von Microtubuli in IMAs benötigt werden. Wir rekonstruierten hoch auflösende 3D Volumina von Hefezellen welche kein Mto1p, Ase1p oder Klp2p Protein besitzen, sowie alle möglichen Variationen dieser Doppelmutanten. Wir zeigen, dass Zellen welche kein Ase1p besitzen zwar noch überlappende microtubuli Regionen haben, jedoch einen veränderten inter-microtubuli Abstand aufweisen. Des Weiteren scheinen die microtubuli von Zellen, welche weder Ase1p noch Klp2p besitzen ihre Verbindung zum Spindelpolkörper (SPB) verloren zu haben. Die IMAs von Zellen ohne Klp2p bestehen meistens nur aus zwei- anstelle von zwei bis neun microtubuli im Wildtypen. Ein ähnlicher Phänotyp zeigte sich auch in mto1 mutierten Zellen und in der mto1, klp2 Doppelmutante. Die mto1, ase1 Doppelmutante bildete IMAs welche aus drei microtubuli bestanden, die sich interessanter Weise über die gesamte Zell-Länge erstreckten. Sowohl mto1- als auch mto1, ase1 mutierte Zellen besitzen intra-nukleare microtubuli welche eine besondere Organisation besitzen. Des Weiteren zeigen wir, dass die von wild typischen Zellen abweichenden IMA Strukturen in den oben genannten Mutanten das Mitochondriennetzwerk beeinflussen. Die elektronentomographische Analyse der ase1 mutierten Zellen zeigt, dass die IMAs immer noch überlappende microtubuli Regionen besitzen, jedoch einen veränderten inter-microtubuli Abstand aufweisen. Diese Beobachtungen weisen auf die Existenz weiterer Proteine hin, die für den Bündelungsprozess von microtubuli mitverantwortlich sind. Wir zeigen, dass die meisten microtubuli in mto1 mutierten Zellen offene Endstrukturen besitzen. Diese offenen Endstrukturen können zum sogenannten “Treadmilling” von microtubuli führen, bei welchem hinten Tubulin ab- und vorne angebaut wird. Ausserdem weist die Tatsache, dass die IMAs von Zellen ohne Mto1p und/oder Klp2p nur zwei microtubuli besitzen darauf hin, dass Klp2 am Bildungsprozess neuer microtubuli beteiligt ist. Wir präsentieren ein Modell in dem wir versuchen die Bildung stabiler IMAs zu erklären. Abschließend wird der Effekt der vom Wildtypen abweichenden IMA Strukturen auf das Mitochondriennetzwerk diskutiert.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Robinson, Prof. Dr. D. G.,
Date of thesis defense: 20 November 2008
Date Deposited: 23 Feb 2009 09:13
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Schizosaccharomyces pombe MicrotubuliSchizosaccharomyces pombe Microtubules
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