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Evaluation of cytokine-transducing parvoviralvectors for glioma therapy

Kleinmann, Elodie

German Title: Evaluierung von Zytokin-transduzierenden parvoviralen Vektoren in der Gliom Therapie

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Abstract

Maligne Gliome sind die am häufigsten bei Erwachsenen auftretenden Hirntumor. Trotz großer Fortschritte in der konventionellen Behandlung, die aus Neurochirurgie, gefolgt von Strahlen- und Chemotherapie besteht, haben maligne Gliome eine sehr schlechte Prognose. Daher bedarf es dringend einer Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. Die virale Gentherapie stellt eine interessante Alternative oder auch Adjuvans zur konventionellen Krebstherapie dar. Die autonomen Nagetierparvoviren sind aufgrund ihrer onkotropischen und onkolytischen Eigenschaften, sowie ihrer niedrigen Pathogenität besonders attraktive Kandidaten für die Entwicklung viraler Vektoren für die Gentherapie gegen Krebs. Gliome sind hochvaskularisierte Tumore, die ein stark immunsuppressives Milieu erzeugen. Daher wurde in unserem Labor vor kurzem die antitumoralen Effekte parvoviraler Vektoren, die das humane Interferon-γ-induzierte Protein-10(hIP-10)und den murinen Tumornekrosefaktor-α (mTNF-α) transduzieren, in einem syngenen, murinen Gliom-Modell untersucht. IP-10 und TNF-α sind Zytokine, die für ihre immunostimulatorischen und antiangiogenischen Eigenschaften bekannt sind. Diese rekombinanten Viren konnten das Wachstum von murinen GL261-Gliomzellen, die subkutan in immunkompetente Mäuse appliziert wurden, signifikant hemmen. Die Koinfektion der Gliomzellen mit beiden Vektoren führte zu einer kompletten Tumorregression, was auf einen synergistischen antitumoralen Effekt schließen lässt (Enderlin et al., 2008). In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen, die zu einer Hemmung des Tumorwachstums durch TNF-α- und IP-10-kodierende parvovirale Vektoren führten, untersucht. Parvoviral transduziertes TNF-α verstärkte die mRNA-Expression und Proteinsekretion von endogenem IP-10 in GL261-Zellen in vitro. Die Kombination von beiden Viren könnte auf diese Weise in IP-10-Mengen resultieren, die oberhalb eines kritischen Schwellenwertes liegen und so zu den in vivo beobachteten synergistischen antitumoralen Effekten führen. Die Analyse der zellulären Immunantwort nach peritumoraler Applikation der rekombinanten Parvoviren in etablierte, subkutane GL261 Tumore zeigte eine verringerte Tumorinfiltration von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten im Vergleich zu PBS behandelten Tumoren. Auffallend war die drastisch verringerte Tumorinfiltration von CD4+ T-Lymphozyten durch die Behandlung mit den Zytokin-kodierenden Vektoren, die mit dem Tumorwachstum in vivo umgekehrt korrelierte. Wir vermuten, dass die antitumoralen Effekte auf einer Verringerung der CD4+ regulatorischen T-Zellen beruhen, welche eine Suppression von Immunantworten verursachen. Zudem konnten wir zeigen, dass die in vitro Infektion von GL261-Zellen mit Zytokin-kodierenden Vektoren zu einer Verringerung an TGF-β führte, welche stark mit der Infiltration von CD4+ T-Lymphozyten korrelierte. Desweiteren wurden die antitumoralen Effekte der mTNF-α- und hIP-10-transduzierenden parvoviralen Vektoren auf GL261-Zellen untersucht, die intrakranial in syngene C57BL/6 Mäuse implantiert wurden. Hierzu wurden das Tumorwachstum der mit parvoviralen Vektoren präinfizierten GL261-Zellen sowie die Überlebensrate der behandelten Mäuse beobachtet. Wildtyp Parvovirus und der virale Vektor ohne Transgen zeigten nur einen schwachen antitumoralen Effekt. Dies gleicht den Resultaten aus dem subkutanen Tumorversuch. Im Gegensatz hierzu, konnte TNF-α-, jedoch nicht IP-10-kodierende parvovirale Vektoren im intrakranial Tierversuch zu einer signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums der GL261 Gliome sowie zu einem verlängerten Überleben der tumortragenden Mäuse führen. Zudem wurde kein synergistischer Effekt zwischen TNF-α und IP-10 beobachtet. Immunohistochemische Untersuchungen der Hirntumorproben zeigten, dass die parvovirale Infektion zu einer mäßigen Infiltration von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten führte. Der TNF-α-transduzierende parvovirale Vektor verringerte die Vaskularisierung des Tumors und die Infiltration von CD68+ Makrophagen/Mikroglia. Dies scheint für die beobachteten antitumoralen Effekte verantwortlich zu sein. Die Monozyten chemotaktisches Proteine (MCP)-2 und -3 sind potente immunaktive Zytokine, die eine Vielzahl an Leukozyten rekrutieren. Es konnte gezeigt werden, dass MCP-3-transduzierende parvovirale Vektoren das Tumorwachstum in verschiedenen Tiermodellen hemmen. Dies veranlasste uns die Effekte von MCP-2- und MCP-3-transduzierenden vektoren im intrakranialen GL261-Gliom-Modell mit denen von TNF-α und IP-10 zu vergleichen. Es konnten jedoch keine Effekte auf Tumorwachstum und Überlebensrate beobachtet werden. Wir vermuten, dass MCP-2 und MCP-3 in den GL261-Zellen prozessiert werden, was zu ihrer Inaktivierung führt.

Translation of abstract (English)

Malignant gliomas are the most frequent primary brain tumors in adults and have a poor prognosis, despite advances in the conventional treatment involving neurosurgery, followed by radiation- and chemotherapy. Hence, there is a great need for the development of novel therapeutic approaches. Gene therapy based on viral vectors represents an interesting alternative or adjuvant to conventional cancer therapies. The oncotropic and oncolytic properties of rodent autonomous parvoviruses, together with their low pathogenicity make them particularly attractive candidates as viral vectors for cancer gene therapy. Gliomas are highly vascularized tumors that induce a strong immunosuppressive environment. Therefore, our laboratory has recently investigated the antitumor effects of parvoviral vectors delivering human interferon inducible protein-10 (hIP-10) and mouse tumor necrosis factor-α (mTNF-α), cytokines known to have both immunostimulatory and antiangiogenic properties, in a syngeneic mouse glioma model. These recombinant viruses strongly inhibited the growth of murine GL261 glioma cells grafted subcutaneously in immunocompetent mice. Complete tumor regression was observed when glioma cells were coinfected with both vectors, demonstrating synergistic antitumor effects (Enderlin et al., 2008). In the present study, the mechanisms sustaining subcutaneous tumor inhibition by TNF-α- and IP-10-encoding parvoviral vectors were investigated. Parvoviral-transduced TNF-α increased the mRNA expression and protein secretion of endogenous IP-10 in GL261 cells in vitro. When both viruses were used in combination, the IP-10 levels may thus reach a critical threshold that could account for the synergistic antitumor effects observed in vivo. The analysis of the cellular immune response upon peritumoral injections of recombinant parvoviruses in established subcutaneous GL261 tumors showed a decreased infiltration of CD4+ and CD8+ T lymphocytes compared to PBStreated tumors. More strikingly, the infiltration of CD4+ T lymphocytes was dramatically decreased in tumors treated with cytokine-encoding vectors and inversely correlated with the tumor growth in vivo. We hypothesize that the antitumor effects could be due to a decrease of CD4+ T regulatory cells, known to suppress immune responses. In agreement with this, we could show that in vitro infection of GL261 cells with cytokine-encoding vectors led to a decrease of TGF-β that strongly correlated with the infiltration of CD4+ T cells. Next, the antitumor effects of parvoviral vectors transducing mTNF-α and hIP-10 were investigated on GL261 implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice. The tumor growth and survival of mice implanted with GL261 cells in vitro infected with parvoviral vectors were monitored. Wild-type parvovirus and the vector devoid of transgene had only a slight antitumor effect, similarly to the results obtained subcutaneously. In contrast, in the intracranial setting, TNF-α-, but not IP-10-encoding vector significantly delayed the tumor growth of GL261 glioma and prolonged the survival of tumor-bearing mice. No synergy between TNF-α and IP-10 could be observed in this setting. Immunohistochemical analysis on brain tumor samples showed that parvoviral infection induced a moderate infiltration of CD4+ and CD8+ T lymphocytes. The TNF-α-transducing parvoviral vector decreased tumor microvascularization as well as the infiltration of CD68+ macrophages/microglia, and these effects are likely responsible for the antitumor effects observed. The monocyte chemotactic protein (MCP)-2 and -3 are known to be potent immunoactive cytokines, recruiting a broad range of leukocytes. Parvoviral vectors delivering MCP-3 were shown to inhibit the tumor growth in several animal tumor models. This prompted us to compare the effects of parvoviruses delivering MCP-2 and MCP-3 in the GL261 intracranial glioma model to those obtained with parvoviral vectors transducing TNF-α and IP-10. No effects on tumor growth and animal survival could be observed, suggesting a possible processing of MCP-2 and MCP-3 by GL261 cells, leading to their inactivation.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Régnier-Vigouroux, Dr. Anne
Date of thesis defense: 2. March 2009
Date Deposited: 03. Mar 2009 11:42
Date: 2009
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Parvoviren, Gliom, Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>, Gentherapie, Chemokine
Uncontrolled Keywords: Parvovirale Vektoren , Interferon-Gamma-induziertes Protein-10 (IP-10)parvoviral vectors , glioma , gene therapy , tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) , interferon inducible protein-10 (IP-10)
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