German Title: Aktivierung der angeborenen Immunität durch Ribonukleinsäuren

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Abstract

RNA provides a stimulus for innate immunity either by activating the endosomal Toll-like receptors (TLRs) 3, 7 and 8 or by triggering cytosolic RNA sensors of the RIG-I-like family (RLRs) or the NALP3-containing inflammasome. RNA recognition results in the secretion of type-I interferons or proinflammatory cytokines. Recognition of RNA is supposed to occur due to the presence of non-self structures, such as the abundance of nucleotide modifications, guanosine-uridine-rich sequences, double-stranded conformation or the presence of a terminal 5’-triphosphate. However, the exact structural requirements for RNA recognition are still largely unknown. Within this work the functional and structural interplay between RNA and different receptors within cells of the innate immune system was analyzed. In detail, bacterial RNA, synthetic siRNA and in vitro transcribed RNA was characterized. It can be shown that TLR7 is the responsible receptor for the recognition of siRNA in plasmacytoid dendritic cells resulting in induction of type-I interferons which mediate unwanted off-target effects. Besides a minor sequence-dependent influence, introduction of nucleotide modifications identified the 2’-position of the ribose to be crucial for TLR7-mediated immunorecognition. Further, hyperchromicity assays and structure prediction give strong evidence that stimulating RNA adopts a duplex structure. These findings suggest that immunorecognition takes place within the minor groove of a given RNA duplex, thus revealing a possible mechanism of receptor ligand interaction. Confirming this notion, the introduction of different nucleotide modifications altering major groove recognition showed no effect on immunorecognition. Of note, incorporation of thymidine substitutions was demonstrated to reduce immunostimulation without any effect on gene knockdown. These results identify modifications that dissect unwanted immunostimulation from RNA interference in siRNA, thus paving the way for more precise therapeutic applications. Next, the immunostimulatory potential of different prokaryotic RNAs was tested. It could be shown that recognition of bacterial RNA differs from all principles described so far. Whereas TLR7 mediated recognition in plasmacytoid dendritic cells and NALP3 was responsible for IL-1β secretion, prokaryotic RNA was shown to additionally trigger a cytosolic receptor system resulting in the activation of the transcription factor NFκB and interleukin-12p40 secretion. Using cells from various knockout mice and performing siRNA approaches, all described RNA receptors could be ruled out to be responsible for this activation. Immunostimulation by prokaryotic RNA thus mirrors findings previously described for cytosolic DNA recognition. Finally, ligand specificity of RIG-I was investigated. It could be demonstrated that the 5’-triphosphate moiety is not the only target structure for RIG-I but that RNA in double-stranded conformation represents a second independent structural feature that activates RIG-I. The sensitivity of RIG-I to double-stranded RNA of increasing size was significantly enhanced, indicating that the biological role of RIG-I is rather the sensing of long dsRNA instead of recognizing the terminal 5’-end. Further, there is strong evidence that RIG-I might bind in a cooperative manner to double-stranded RNA structures explaining the significant length-dependency.

Translation of abstract (German)

RNA stellt über die Aktivierung der endosomalen Toll-like Rezeptoren (TLRs) 3, 7 und 8 sowie der zytosolischen RNA Sensoren aus der Familie der RIG-I-like Rezeptoren oder des NALP3 Inflammasoms einen Stimulus für das angeborene Immunsystem dar. Die Erkennung von RNA führt zur Sekretion von Typ-I Interferonen oder proinflammatorischen Zytokinen. Die Erkennung von RNA erfolgt dabei über das Vorhandensein von „Nicht-Selbst“ Strukturen, wie Guanosin-Uridin-reiche Sequenzmotive, doppelsträngige Konformation, eine terminale 5’-Triposphatgruppe oder die Art und Häufigkeit von Nukleotidmodifikationen. Über die strukturellen Einzelheiten der RNA Erkennung ist aber nach wie vor wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die funktionellen und strukturellen Wechselwirkungen zwischen RNA und verschiedenen Rezeptoren im angeborenen Immunsystem genauer analysiert. Im Einzelnen wurden bakterielle RNA, synthetische siRNA und in vitro transkribierte RNA untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TLR7 der Rezeptor für siRNA in plasmazytoiden dendritischen Zellen ist und dass siRNA über die TLR7 Stimulation zur Ausschüttung von Typ-I Interferonen führen kann, welche ungewollte Nebenwirkungen bei siRNA Applikationen bedingen. Neben einem geringen sequenzspezifischen Beitrag wurde durch die Einführung entsprechender Modifikationen die 2’ Position der Ribose als entscheidende Struktur für die Erkennung durch TLR7 identifiziert. Hyperchromizitätsanalysen und Strukturvorhersagen wiesen außerdem daraufhin, dass stimulative RNA Moleküle doppelsträngige Strukturen annehmen. Der Mechanismus der Erkennung von RNA durch TLR7 könnte damit über eine Interaktion des Rezeptors mit der kleinen Furche einer RNA Duplex erklärt werden. Unterstützend zu diesen Befunden zeigten Modifikationen der grossen Furche keinen Effekt auf die Immunstimulation. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Substitution von Uracil durch Thymidin die Immunstimulation durch siRNA deutlich reduzierte, während die gensuppressive Funktion unverändert blieb. Die Ergebnisse ermöglichen somit die Synthese von siRNA Molekülen, die eine gezielte Applikation ohne Immunaktivierung erlauben. Als nächstes wurde die Immunstimulation durch prokaryotische RNA analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Erkennung prokaryotischer RNA von den bisher beschriebenen RNA-Erkennungsmechanismen abweicht. Neben der Erkennung durch TLR7 in plasmazytoiden dendritischen Zellen und der NALP3-vermittelten Interleukin-1β Sekretion, aktivierte prokaryotische RNA zusätzlich ein zytosolisches Rezeptorsystem, das zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB und zur Sekretion von Interleukin-12p40 führt. Durch Verwendung von knockout Mausmodellen sowie durch den Einsatz von siRNA konnten alle bisher beschriebenen RNA Rezeptoren ausgeschlossen werden. Die Erkennung prokaryotischer RNA zeigt damit Parallelen zu der kürzlich beschriebenen zytosolischen Erkennung von prokaryotischer DNA. In einem dritten Teil der Arbeit wurde die Ligandenspezifität von RIG-I charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass eine terminale 5’-Triphosphatgruppe nicht die einzige Erkennungsstruktur in viraler RNA darstellt, sondern dass auch die Dopplestrangkonformation von RNA als unabhängiger Stimulus für RIG-I fungiert. Die Sensitivität von RIG-I stieg dabei signifikant mit der Länge des doppelsträngigen RNA Liganden an. Dies deutet daraufhin, dass die biologische Funktion von RIG-I vielmehr die Erkennung doppelsträngiger Strukturen als die Erkennung der 5’ Triphosphatgruppe ist. Zudem weist die stark längenabhängige Erkennung auf eine kooperative Bindung von RIG-I an Doppelstrangstrukturen hin.