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Isoform specificity of 14-3-3 proteins in COPII dependent ER export of membrane proteins

Mrowiec, Thomas

German Title: Isoformenspezifität von 14-3-3 Proteinen beim COPII abhängigen Vorwärtstransport von Membranproteinen

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Abstract

Die beiden Proteine Bmh1 und Bmh2 aus der Bäckerhefe gehören der grossen 14-3-3 Proteinfamilie an. 14-3-3 Proteine sind konserviert in allen eukaryotischen Zellen und haben die Eigenschaft als Dimere aufzutreten. Sie wurden als weiterverbreite Modulatorproteine beschrieben und mit einer Vielzahl verschiedener, essenzieller Zellvorgänge in Verbindung gebracht. Die verschiedenen Isoformen der 14-3-3 Familie weisen eine sehr ähnliche Struktur auf und man nimmt an, dass sie zumindest teilweise überlappende Funktionen haben und oftmals eine Isoform durch eine andere ersetzt werden kann. Eine der vielen Rollen von 14-3-3 Proteinen liegt in der Unterstützung des Forwärtstransports von multimeren Membranproteinen. Neueste Erkenntnisse aus unserer Arbeitsgruppe zeigten eine isoformspezifische Funktion der 14-3-3 Bmh1 Isoform auf. Der isoformspezifische Funktionsmechanismus jedoch blieb bisher unerklärt. Der Fokus meiner Arbeit liegt in der Aufklärung des isoformspezifischen Funktionsmechanismus, der verantwortlich ist dafür, dass die Bmh1 Isoform, nicht aber Bmh2, den Vorwärtstransport von multimeren Membranproteinen fördert. Mit Hilfe eines gut charakterisierten Reportersystems in Saccharomyces cerevisiae war es mir möglich, qualitative und quantitative Methoden zu kombinieren. Meine Ergebnisse zeigen, dass die Gleichgewichts-Lokalisation des gewählten Reporterproteins durch Regulation des Austritts aus dem ER (Endoplasmatisches Retikulum) zustande kommt. Die Bildung von COPII Vesikeln am ER war weniger effizient in einem d_bmh1 Stamm, als im Wildtyp-Stamm. Die Interaktion zwischen der COPII Komponente Sec23 und beiden 14-3-3 Proteinen wurde nachgewiesen. Mutationen in einem putativen 14-3-3 Bindungsmotif in Sec23 führten zur fehlerhaften Lokalisation von zirkulierenden Membranproteinen in vivo. Desweiteren wurde der C-Terminus von Bmh1 als die Region identifiziert, die für den isoformspezifischen Effekt verantwortlich ist. Pulldown-Versuche mit den C-Termini von Bmh1 und Bmh2 führten zur Identifizierung von Ndk1, einer Nukleosid-Diphosphat-Kinase, als neuen Interaktionspartner für die 14-3-3 Isoformen in Hefe. Mit Hilfe von in vitro COPIIbudding- assays konnte ich zeigen, dass Bmh1 und Ndk1 zusammen die Bildung von COPIIVesikeln an der ER Membran fördern. Im Gegensatz dazu wurde ein dominant negativer Effekt für Bmh2 im Komplex mit Ndk1 entdeckt. Ich spekuliere, dass 14-3-3 Proteine in Kombination mit Ndk1 den Transport von zirkulierenden Proteinen über strukturelle Regulation der COPII-Vesikelbildung regulieren.

Translation of abstract (English)

The two 14-3-3 proteins Bmh1 and Bmh2 belong to a large family of dimeric proteins, which are conserved in all eukaryotic cells. They have been described as abundant modulators and linked to a broad range of essential cellular processes. 14-3-3 isoforms are highly similar in their structure and thought to have a least partially overlapping functions. One role of 14-3-3 proteins is to facilitate forward transport of multimeric membrane proteins. Recent work in our group has revealed an isoform specific function for the yeast 14-3-3 isoform Bmh1. However, the mechanism by which only 14-3-3 Bmh1, but not Bmh2, promotes forward transport is not known. In this work, I focus on the investigation of the mechanism that causes isoform specificity of 14-3-3 proteins in the forward transport of multimeric membranes proteins. I chose a well defined reporter system in Saccharomyces cerevisiae, that allowed me to combine qualitative and quantitative methods. My results show that different steady-state localizations of the reporter are due to differences in ER export efficiency, because formation of COPII coated vesicles is less efficient in a d_bmh1 background. Both yeast 14-3-3 proteins were shown to interact with the COPII component Sec23. Mutating a putative 14-3-3 binding site in Sec23 resulted in mislocalization of cycling proteins in vivo. Furthermore, 14-3-3 Bmh1 was found to fulfill its stimulatory role through its distal C-terminal region. Pulldown studies with Bmh1 and Bmh2 C-termini identified a nucleoside diphosphate kinase (Ndk1) as a new interaction partner of yeast 14-3-3 proteins. In vitro packaging assays were used to demonstrate that Bmh1 and Ndk1 act at the level of vesicle formation from ER membranes. In contrast, a dominant negative role of Bmh2 in complex with Ndk1 was discovered. I speculate, that 14-3-3 proteins in combination with Ndk1 might influence transport kinetics of cycling proteins by structural regulation of COPII vesicles.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Mayer, Dr. PD Matthias
Date of thesis defense: 14 May 2009
Date Deposited: 16 Jun 2009 14:23
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: 14-3-3 , COPII , Membraneproteine , ER-Export , Ndk114-3-3 , COPII , membrane proteins , ER export , Ndk1
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