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Investigation of Molecular Interactions in Cytoskeletal Systems with Holographic Optical Tweezers

Uhrig, Kai

German Title: Untersuchungen molekularer Wechselwirkungen in Zellskelettsystemen mit holographisch optischen Pinzetten

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Abstract

Optical tweezers are a versatile tool to apply and measure forces in the piconewton range on microscopic ob jects that are held by optical forces in a focussed laser beam. We employed holographic optical tweezers (HOT) to create extended force sensor arrays, consisting of multiple trapped particles that were controlled and probed individually. The combination of high-speed video microscopy with fluorescence imaging allowed the visualization of labeled protein structures in parallel with the tracking of multiple trapped particles for force measurements. Using this setup, we could perform quantitative force measurements on biological samples with HOT for the first time. To obtain reliable force measurements, calibration methods based on power spectra analysis were adapted for holographic optical tweezers. In microfluidic environments, biomimetic structures of the cellular cytoskeleton could be reconstituted between optically trapped microspheres. Flow cells and fluidic control, developed in this work allowed the exchange of solutions in the system and thus, the complete control of the chemical environment without generating forces that would affect the trapped particles. This provided the possibility to measure dynamic processes such as the contractility of two-dimensional cross-linked actin networks in the microfluidic flow cell. A network of actin fibers between seven trapped particles was created and the forces during cross-linking were obtained. To investigate bundling processes between filaments, a method has been established using dynamic HOT to manipulate zipper-like structures between trapped particles actively. Analysis of particle trajectories during zipping of filaments allowed the determination of binding energies between filaments. Unbundling forces between actin filaments were measured on trapped spheres during the active process of unzipping. Additionally, this system was transferred to actin networks on PDMS micropillar substrates to improve feasibility. In combination with the optical trap, this allowed for the investigation of unbundling forces for alpha-actinin as well as for magnesium ions as cross-linkers. In a different set of experiments, the adhesion process of the Malaria causing parasite Plasmodium was investigated. Adhesion and locomotion of the sporozoites is crucial for the infectivity of the parasite. A methodology for laser tweezer experiments with Plasmodium sporozoites was developed. Using optical tweezers, the formation of adhesion sites in the presence of actin disrupting drugs was probed and compared to knock-out parasite strains. We found the second step of sporozoite adhesion sequence to be significantly dependend on actin and a specific transmembrane protein named TRAP.

Translation of abstract (German)

Optische Pinzetten stellen ein vielseitiges Werkzeug für die Erforschung und die Anwendung molekularer Kräfte dar. Dabei werden mikroskopische Partikel durch optische Kräfte im Fokus eines Lasers gefangen, die anschließend als Kraftsensoren verwendet werden können. In dieser Arbeit wurden holographische optische Pinzetten eingesetzt, um ausgedehnte Mehrpunktkraftsensoren zu generieren, die aus mehreren parallel gefangenen Polystyrolkügelchen bestanden. Durch die Kombination von Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie war es möglich, sowohl die in der Falle gehaltenen Mikropartikel als auch Proteinstrukturen zwischen den Partikeln abzubilden und dynamische Prozesse zu verfolgen. Zur Kalibration der optischen Kräfte wurde die Analyse von Leistungsspektren auf die holographisch optischen Pinzetten angewandt. Dies erlaubte die zuverlässige Kalibrierung auch in der Gegenwart von externen Störungen, wie sie in Mikrofluidiksystemen häufig vorkommen. Der Einsatz von Mikrofluidiksystemen ermöglichte die gezielte Generierung und Modifizierung biomimetischer Proteinstrukturen. Hierfür wurde eine spezielle Mikrofluidikplattform entwickelt, die den Austausch von Medien in der Umgebung der optischen Fallen erlaubte ohne die Messungen zu beeinträchtigen. Bis zu sechs unabhängige Kanäle konnten einzeln in Pikolitergenauigkeit angesteuert werden, um so komplexe Experimente in der Flusszelle zu ermöglichen. Exemplarisch für die Fähigkeiten des Systems wurde ein zweidimensionales Aktinnetzwerk als Modell für den Zellcortex erzeugt und die Kräfte bei der Kontraktion durch anschließende Quervernetzung der Filamente gemessen. Zur Bestimmung der Adhäsionsenergie zweier Aktinfilamente, wurden Partikeltrajektorien während des Bündelungsvorganges analysiert. Aus den hydrodynamischen Reibungskräften ließ sich die Bündelungsenergie pro Längeneinheit des Filaments bestimmen. Bündelungskräfte zwischen einzelnen Aktinfilamenten konnten durch aktive Krafteinwirkung mittels holographischer optischer Pinzetten und in einem kombinierten Aufbau aus optischen Pinzetten und Mikrosäulensubstraten gemessen werden. In weiteren Experimenten wurde der molekulare Hintergrund der Adhäsionssequenz von Plasmodium Sporozoiten an Oberflächen untersucht. Die Gattung Plasmodium stellt den parasitären Erreger von Malaria, wobei Sporozoiten das motile Stadium des Parasiten darstellen, welches von Moskitos auf den Endwirt übertragen wird. Die Interaktion mit Oberflächen im Sporozoiten Stadium spielt eine wichtige Rolle beim Infektionsprozess im Menschen. Die Rolle des Transmembranproteins TRAP und von F-Aktin für die Ausbildung von Adhäsionen wurde mit den optischen Pinzetten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine initiale Adhäsion auch in der Gegenwart von Aktin zerstörenden Sub- stanzen sowie für Parasiten ohne TRAP möglich ist, die Bildung eines zweiten Anheftpunktes für die Sporozoiten jedoch von TRAP und Aktin abhängt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Dr. Joachim P.
Date of thesis defense: 6. May 2009
Date Deposited: 30. Jun 2009 13:05
Date: 2009
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Biophysik, Optische Pinzette, Mikrofluidik, Actin, Actin-bindende Proteine, Actin-Filament, Malaria, Plasmodium berghei, Zelladhäsion
Uncontrolled Keywords: Proteinnetzwerke , Proteinbündel , Zellkortex , Holographisch optische Pinzettecross-linkining , protein networks , Actin-Zipper , Cell Cortex , Holographic optical tweezers
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