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Lipids as Trans Acting Factors for the Transport of Integral Membrane Proteins

Fischer, Marcel

German Title: Lipide als trans-agierende Faktoren für den Transport integraler Membranproteine

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Abstract

Ist2 ist ein integrales, polytopisches Membranprotein in Saccharomyces cerevisiae. Ein Teil der IST2 mRNA wird zur Spitze der Tochterzelle transportiert, wo das Protein lokal am kortikalen endoplasmatischen Retikulum (ER) translatiert wird. Nach der Translation in Mutterzellen akkumuliert Ist2 sehr schnell in Domänen des kortikalen ERs. Für diese kortikale Lokalisation ist ein Protein-Signal ausreichend, das sich in den letzten 69 Aminosäuren des cytosolisch orientierten C-Terminus von Ist2 befindet (kortikales Sortierungssignal von Ist2, CSSIst2). Vor allem hydrophobe und basische Aminosäuren, die eine amphipathische Helix bilden, sind von Bedeutung für den Transport von Ist2. Das CSSIst2 wirkt als dominantes Signal über andere Proteinsortierungssignale, so kann es verschiedene Golgi- und ERMembranproteine effizient in Domänen des kortikalen ERs umleiten. Die Lokalisation von Ist2 im kortikalen ER ist unabhängig von einem funktionellen sekretorischen Weg (sec). Ist2 ist zugänglich für Proteasen, die zu intakten Hefezellen zugegeben werden. Daher wurde für Ist2 ein sec-unabhängiger Transportweg von Domänen des kortikalen ERs zur Plasmamembran (PM) vorgeschlagen. Das Ziel dieser Doktorarbeit bestand in der Aufklärung des molekularen Mechanismus, der für den effizienten Transport von Ist2 zum kortikalen ER verantwortlich ist. Ich konnte zeigen, dass das lösliche CSSIst2 in vivo an die Hefe-PM bindet. Diese Membranbindung konnte als eine Interaktion des CSSIst2 mit Lipiden der PM identifiziert werden. Durch in vitro-Versuche mit Liposomen definierter Zusammensetzung konnte ich Phosphatidylinositolphosphate (PIPs) als die Lipidklasse identifizieren, die die stärkste Interaktion mit CSSIst2 aufweist. Diese Protein-Lipid-Interaktion hängt von basischen Resten des CSSIst2, sowie dessen Multimerisierung ab. Das an der PM am stärksten angereicherte PIP ist Phosphatidylinositol[4,5]-bisphosphat (PtdIns[4,5]P2). Daher ersetzte ich das kortikale Sortierungssignal von Ist2 durch eine charakterisierte PtdIns[4,5]P2-Bindungsdomäne aus Phospholipase C-δ1. Das chimäre Protein lokalisiert unter allen getesteten Bedingungen wie Wildtyp-Ist2 und komplementiert durch das Reagenz Calcofluor weiß hervorgerufene Zellwanddefekte von ist2-knockout-Stämmen. Diese Daten zeigen, dass für den Transport von Ist2 zum kortikalen ER die Bindung von Lipiden der PM notwendig und ausreichend ist. Nach der Translation von Ist2 dient das CSSIst2 als Lipid-Bindungsdomäne, die das Protein effizient an Kontakten zwischen ER und PM verankert. Fusionsproteine aus verschiedenen Golgi- und ER-Membranproteinen und der PtdIns[4,5]P2- Bindungsdomäne aus Phospholipase C-δ1 werden effizient in das kortikale ER umgeleitet. Dieser neu entdeckte Sortierungsmechanismus für integrale Membranproteine ist dominant über Signale für den Export von Proteinen aus dem ER und dominant über den proteasomalen Abbau instabiler ER-Proteine, was die Effizienz der Proteinsortierung durch Protein-Lipid- Interaktionen aufzeigt.

Translation of abstract (English)

Ist2 is an integral, polytopic membrane protein of Saccharomyces cerevisiae. Some of the IST2 mRNA is localized to the bud tip of the daughter cell, where the protein is locally translated at the cortical endoplasmic reticulum (ER). After its translation in mother cells, Ist2 rapidly accumulates at domains of the cortical ER. This cortical localization is mediated by a protein signal localized within the last 69 amino acids of the cytosolic Ist2 C-terminus (cortical sorting signal of Ist2, CSSIst2). In particular, certain hydrophobic and basic amino acids, which form an amphipathic helix, are important for Ist2 transport. The CSSIst2 is a dominant sorting signal, it can redirect different Golgi- and ER localized membrane proteins efficiently to domains of the cortical ER. Ist2 localizes to the cortical ER independently of a functional secretory pathway (sec). Moreover, Ist2 is accessible to proteases added to intact yeast cells, suggesting a secindependent transport mechanism from domains of the cortical ER to the plasma membrane (PM). The aim of this thesis was to identify the molecular mechanism responsible for the efficient transport of Ist2 to the yeast cortical ER. I was able to show that the soluble CSSIst2 in vivo binds to the yeast PM. This membrane binding could be identified as an interaction between the CSSIst2 and lipids of the PM. In vitro binding assays using liposomes of a defined composition revealed phosphoinositides (PIPs) as the lipid class showing the strongest interaction with CSSIst2. This protein-lipid interaction depends on certain basic residues of the CSSIst2 and its multimerization. The PIP showing the strongest enrichment at the PM is Phosphatidylinositol[4,5]-bisphosphate (PtdIns[4,5]P2). Therefore, I replaced the cortical sorting signal of Ist2 by a characterized PtdIns[4,5]P2 binding domain from Phospholipase C-δ1. The chimeric protein localized under all tested conditions like wild type Ist2 and complements cell wall defects of ist2-knockout strains caused by calcofluor white. My data show that a binding of PM lipids is necessary and sufficient for the transport of Ist2 to the cortical ER. After translation of Ist2 the CSSIst2 serves as a lipid-binding domain, which efficiently anchors the protein at organelle junctions between the ER and the PM. Fusion proteins of different Golgi- and ER localized membrane proteins and the PtdIns[4,5]P2 binding domain from Phospholipase C-δ1 are efficiently redirected to the cortical ER. This novel sorting mechanism for integral membrane proteins is dominant over signals responsible for ER export and dominant over the proteasomal degradation of unstable ER proteins. This demonstrates the efficiency of protein sorting via protein-lipid interactions.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Seedorf, Dr. PD Matthias
Date of thesis defense: 18. June 2009
Date Deposited: 21. Jul 2009 08:33
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Ist2 , Membranprotein , ER Subdomänen , Lipide , PtdIns(4,5)P2Ist2 , membrane protein , ER subdomains , lipid binding , PtdIns(4,5)P2
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