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Dynamics and Architecture of the HOPS Tethering Complex in Yeast Vacuole Fusion

Ostrowicz, Clemens Werner

German Title: Dynamik und Architektur des HOPS Tethering-Komplex bei der Vakuolenfusion in Hefe

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Abstract

The evolvement of a complex endomembrane system, which is separating a variety of biochemical processes into distinct compartments, is a hallmark of eukaryotic cell development. Cellular homeostasis depends on the abilities of these lipid bilayer-enclosed organelles both to maintain distinct characteristics and to exchange materials. This is mainly achieved by a process called vesicular transport, which allows for a constant exchange of proteins, lipids and metabolites between different compartments. Lipid bilayer enclosed vesicles bud from the donor compartment, are transported to the target compartment and fuse with its surrounding membrane. The basic machineries involved in the process in budding and fusion have been intensely investigated in the last years. However, our knowledge about the processes, which confer target specificity and regulate intracellular membrane fusion, is still limited. Before fusion of two-compartments can occur, they have to specifically recognize and bind each other to allow for subsequent SNARE-induced fusion to take place. This early step in the fusion reaction is called tethering and involves the action of tethering factors and Rab GTPases. In my research, I focused on the HOPS protein complex that is implicated to function in the tethering process at the yeast vacuole, the fungal equivalent of lysosomes. To investigate the molecular properties that confer the functionality of this large hexameric complex, I established a method that allowed for the purification of substantial amounts of HOPS and investigated the interactions taking place between different subunits. This work paved the ground for electron microscopy analysis of the whole complex, which is currently performed and which yielded first, preliminary data. Furthermore, it allowed for the identification of the novel CORVET tethering complex at the endosome, which has several subunits in common with the HOPS complex. I was able to show that chimeric complexes exist, harboring both HOPS- and CORVET-specific subunits. This finding suggests that both complexes are dynamic and can interconvert. During my studies on the subunits’ interactions, I identified stable subcomplexes of the HOPS complex, for one of which I could show that it exists in vivo. The existence of such subcomplexes implies a much more dynamic functioning of the HOPS subunits than previously anticipated. This notion is further strengthened by my studies on the functionality of different subunits and subcomplexes. Intriguingly, my results show that the Rab Guanyl nucleotide exchange factor Vam6, which is needed to activate the vacuolar Rab Ypt7 for subsequent fusion and which is a component of the HOPS complex, loses its ability to interact with Ypt7 upon incorporation into a subcomplex or the fully assembled HOPS complex. In contrast to this, the subunit Vps41, which I could identify as a Rab effector, is active as a single protein and as part of the complex, suggesting that it might sequentially recruit the subcomplexes to assemble into the holo-complex at sites harboring active Ypt7. Another feature of Vps41 was addressed in my work. This protein was previously shown to be phosphorylated by the vacuolar casein kinase Yck3. I identified the phosphorylation sites in the Vps41 sequence, which allowed further studies on the effect of the phosphorylation on the functionality of the protein. In the phosphorylated state, the protein is displaced into the cytosol whereas it accumulates at endosomal-vacuolar fusion sites if phosphorylation is prevented. Intriguingly, we found that Ypt7 overexpression is able to partially rescue the loss of localization in the phosphomimetic mutant, indicating a cross-talk between these two layers of Vps41 regulation.

Translation of abstract (German)

Die Entstehung eines komplexen Endomembransystems, in dem eine Vielzahl biochemischer Prozesse in spezielle Kompartimente aufgeteilt werden, ist ein prägendes Merkmal der Entwicklung eukaryotischer Zellen. Die Fähigkeiten dieser von einer Lipid-Doppelschicht umgebenen Organellen sowohl ihre spezifischen Charakteristika zu erhalten, als auch Stoffe untereinander auszutauschen sind unabdingbar für die Erhaltung der zellulären Homöostase. Dies wird erreicht durch den sogenannten vesikulären Transport, der einen permanenten Austausch von Proteinen, Lipiden and Metaboliten zwischen verschiedenen Kompartimenten erlaubt. Membranumschlossene Vesikel knospen dabei vom Donorkompartiment ab, werden zum Zielkompartiment transportiert und fusionieren dort mit der Lipid-Membran. Die grundlegende Maschinerie, die für diese Prozesse verantwortlich zeichnet, ist in den letzten Jahren intensiv erforscht und charakterisiert worden. Dennoch ist unser Wissen über die Prozesse, die die Spezifität der Fusionsprozesse vermitteln und diese regulieren nach wie vor sehr begrenzt. Bevor zwei membranumschlossene Kompartimente fusionieren können, müssen sie sich spezifisch erkennen und aneinander binden um die anschließende SNARE-induzierte Fusion zu gestatten. Dieser frühe Schritt in der Fusionsreaktion wird als “Tethering” bezeichnet und umfasst die Wirkung von Tethering Faktoren und Rab GTPasen. Wärend meiner Doktorarbeit beschäftigte ich mich hauptsächlich mit dem HOPS Protein Komplex, der beim Tethering an der Hefevakuole, dem Äquivalent der Lysosomen höherer Eukaryoten, seine Funktion ausübt. Um die Eigenschaften des Komplexes, die für seine Funktion wichtig sind, näher untersuchen zu können, etablierte ich eine Methode, die die Aufreinigung größerer Mengen des Komplexes erlaubt und untersuchte, welche Untereinheiten miteinander interagieren. Diese Arbeiten schafften die Voraussetzungen dafür, dass nun elektronenmikroskopische Untersuchungen des gesamten Komplexes durchgeführt werden können, welche bereits erste preliminäre Daten lieferten. Darüber hinaus erlaubten meine Arbeiten die Identifizierung des bis dahin unbekannten, endosomalen CORVET Tethering Komplex, der einige Untereinheiten mit dem HOPS Komplex gemein hat. Ich konnte zeigen, dass chimäre Komplexe existieren, die sowohl HOPS- als auch CORVET-spezifische Untereinheiten enthalten. Diese Entdeckung lässt vermuten, dass beide Komplexe dynamische Strukturen darstellen und ineinander umwandelbar sind. Während meiner Studien zu den Interaktionen zwischen einzelnen Untereinheiten entdeckte ich, dass HOPS aus stabilen Subkomplexen aufgebaut ist und ich konnte für einen von diesen bereits zeigen, dass er in vivo vorkommt. Die Existenz dieser Subkomplexe impliziert eine wesentlich dynamischere Funktionsweise des vakuolären Tetherings, als bisher vermutet. Dieser Eindruck wird weiterhin unterstützt durch meine Studien zur Funktionalität verschiedener Untereinheiten und Subkomplexe. Interessanterweise zeigen meine Ergebnisse, dass der Rab GEF Vam6, der zur Aktivierung des vakuolären Rab Proteins Ypt7 benötigt wird und ein Bestandteil des HOPS Komplexes ist, seine Fähigkeit mit Ypt7 zu interagieren verliert, sobald er in einen Subkomplex oder den HOS Komplex inkorporiert wird. Im Gegensatz dazu funktioniert die HOPS Komponente Vps41, die ich als Rab Effektor identifizieren konnte, sowohl als einzelnes Protein als auch als Bestandteil des HOPS Komplexes. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Vps41 dazu dienen könnte, die einzelnen Subkomplexe an Stellen mit aktiviertem Ypt7 zu rekrutieren und im Verlaufe dessen, der gesamte HOPS Komplex assembliert wird. Eine weitere spezifische Eigenschaft der HOPS Untereinheit Vps41 wurde in meiner Arbeit näher charakterisiert. Frühere Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass dieses Protein von der vakuolären Casein Kinase Yck3 phosphoryliert wird. Mir ist es gelungen, die Phosphorylierungsstellen in der Vps41 Sequenz zu identifizieren. Dies erlaubte die Durchführung weiterer Studien zu dem Effekt der Phosphorylierung auf die Funktionalität des Proteins. Im phosphorylierten Zustand verliert Vps41 teilweise seine perivakuoläre Lokalisierung und liegt vornehmlich zytosolisch vor. Demgegenüber akkumuliert das nicht-phosphorylierte Protein zusammen mit anderen HOPS Untereinheiten an endosomal-vakuolären Fusionsstellen. In Übereinstimmung mit meinen oben genannten Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von Ypt7 die zytosolische Lokalisierung der phosphomimetischen Mutante teilweise rückgängig machen konnte. Dieses Ergebnis impliziert, dass über Yck3-vermittelte Phosphorylierung und die Interaktion mit aktiviertem Ypt7 die Lokalisierung und Funktionalität von Vps41 auf zwei Ebenen reguliert wird.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hurt, Prof. Dr. Ed
Date of thesis defense: 13 July 2009
Date Deposited: 14 Jul 2009 13:25
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > Heidelberg University Biochemistry Center
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Vakuole, Membranfusion, Phosphorylierung, Multiproteinkomplex
Uncontrolled Keywords: HOPS , Tethering , Vakuole , FusionHOPS , Tethering , Vacuole , Fusion
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