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Strategies to reduce photobleaching, dark state transitions and phototoxicity in subdiffraction optical microscopy

Staudt, Thorsten M.

German Title: Strategien zur Verringerung des Photobleichens, der Bevölkerung von Dunkelzuständen und der Phototoxizität in der hochauflösenden optischen Mikroskopie

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Abstract

In all subdiffraction fluorescence microscopy techniques, the theoretically infinite attainable resolution is, in practice, limited by the photobleaching of fluorophores. Repetitive scans of the sample required for e.g. three dimensional recordings, increase photobleaching, dark state transitions and, in case of living cells, phototoxicity. To advance such experiments all possibilities to reduce the photobleaching must be explored. In this thesis, various chemical and physical approaches to tackle photobleaching are studied within the context of stimulated emission depletion (STED) microscopy, which is the first and most prominent method for subdiffraction imaging. The STED setup constructed for this purpose allows for the fast adaptation to new fluorescent dyes, and relies on a novel adaptive spectral and phase filter technique. Furthermore, the optical setup facilitates a gentle exposure strategy, in which the time that the dye is irradiated is significantly reduced. Three-dimensional images can therefore be recorded, and the palette of applicable dyes can be expanded to the blue-green regime by the so far unemployed coumarin derivatives, which are known to be prone to photobleaching. The label itself is another vantage point from which photobleaching limitations in subdiffraction microscopy can be circumvented. For the first time, light-driven modulation of the fluorescence from Mn-doped ZnSe quantum nanocrystals has been established through excited-state absorption (ESA). This enables a new type of far-field fluorescence microscopy with diffraction-unlimited resolution based on quantum dots, which are well known for their superior photostability. The correct sample embedding in the refractive index matching is also of high importance, if spherical aberrations and light scattering are to be minimized to optimize the fluorescence collection. For this purpose, an embedding medium, 2,2´-thiodiethanol (TDE) is introduced, which, by being miscible with water at any ratio, allows for refractive index matching up to that of immersion oil and making high resolution recordings deep within the sample feasible.

Translation of abstract (German)

In allen fluoreszenz-mikroskopischen Methoden, die unterhalb des Abbeschen Beugungslimits arbeiten, ist das theoretisch unbegrenzte Auflösungsvermögen durch Photobleichen der Farbstoffe limitiert. Wiederholtes Abrastern der Probe, wie beispielsweise bei drei-dimensionalen Aufnahmen nötig, erhöht das Photobleichen, die Bevölkerung von Dunkelzuständen, oder, bei lebenden Zellen, die Phototoxizität. Speziell für solche Anwendungen müssen alle Möglichkeiten zur Bleichreduzierung ausgeschöpft werden. In dieser Arbeit werden verschiedene chemische und physikalische Ansätze zur Bleichreduzierung exemplarisch an stimulated emission depletion (STED) Mikroskopie, dem ersten und prominentesten Verfahren zur Bildgebung unterhalb der Beugungsgrenze, erörtert. Das hierfür konzipierte STED Mikroskop kann aufgrund eines neuartigen, einstellbaren Spektral- und Phasenfiltersystems schnell an neue Fluoreszenzfarbstoffe mit verbesserten chemischen und photophysikalischen Eigenschaften angepasst werden und konventionelle Filter mit festgeschriebenen Eigenschaften ersetzen. Ferner erlaubt der optische Aufbau eine schonende Beleuchtungsstrategie. Die erhöhte Auflösung ermöglicht eine viel genauere, lokal angepasste Beleuchtung der Probe. Hiermit werden drei-dimensionale STED Aufnahmen möglich und die Farbstoffpalette um die bislang ungenutzte, bleichanfällige Farbstoffklasse der Cumarine bis in den blaugrünen Bereich erweitert. Der Farbstoff selbst bietet einen weiteren Ansatzpunkt, um bleichbezogene Probleme zu vermeiden. Die Fluoreszenz von Mn dotierten ZnSe Quantum Nanokristallen wird hier erstmals durch Licht via excited-state absorption (ESA) moduliert. Dies ermöglicht eine neue Art der Fernfeldfluoreszenzmikroskopie mit beugungs-unbegrenzter Auflösung basierend auf Quantum Dots, die sich generell durch eine hohe Photostabilität auszeichnen. Die Probeneinbettung ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung, um sphärische Abberationen und Streulicht zu vermeiden, und das Signal-zu-Rausch Verhältnis zu maximieren. Hierfür wird ein vollständig wasserlösliches Einbettmedium, 2,2´-Thiodiethanol (TDE) beschrieben, das die Brechzahl bis hin zu Immersionsöl anpassen kann und hochaufgelöste Aufnahmen tief in fixierten Proben ermöglicht.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hell, Dr. med. h Stefan ()
Date of thesis defense: 27 March 2009
Date Deposited: 28 Sep 2009 11:42
Date: 2009
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Fluoreszenz, Mikroskopie, Bleichen, Hochauflösendes Verfahren, Einbettung <Mikroskopie>
Uncontrolled Keywords: Stimulated Emission Depletion (STED)
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