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Promiscuous gene expression in the thymic medulla – on regulation at the epigenetic and single cell level

Sinemus, Anna

German Title: Promiske Genexpression im medullären Thymusepithel: Regulation auf epigenetischer und auf Einzelzellebene

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Abstract

The immune system is delicately balanced by self-antigen driven tolerance and pathogen-driven immunity. Self-tolerance of the T cell repertoire, which is an essential aspect of this balance, is mediated by multiple mechanisms operating both in the thymus (central tolerance) and in peripheral lymphoid and non-lymphoid organs (peripheral tolerance). Central tolerance, thus self-tolerance of the maturing T-cell repertoire in the thymus, is controlled by negative selection and the induction of regulatory T cells (Treg). These processes are mediated via TCR-MHC/peptide contacts between thymocytes and thymic antigen presenting cells (dendritic cells, thymic epithelial cells). The scope of central tolerance is to a large extent dictated by the expression of tissue-restricted antigens (TRA) by medullary thymic epithelial cells (mTEC), a process known as promiscuous gene expression (pGE). pGE encompasses the ectopic expression of TRA from virtually all tissues of the body in the mTEC population. While increasing insight into the tolerance modes linked to pGE has been gained in the last years, the molecular mechanisms involved in the regulation of pGE in mTEC remain largely obscure. The majority of TRA are expressed in the mature CD80high mTEC population (mTEChigh) whereby expression patterns of individual cells are highly heterogeneous. Only 1-15% of mTEChigh express a given antigen and co-expression patterns have been characterized as highly stochastic. A conspicuous feature of promiscuously expressed genes is their co-localization in chromosomal clusters suggesting a regulation of pGE at the epigenetic level. In order to gain insight into the regulation of such clustered gene expression, we exemplarily investigated the epigenetic regulation of pGE at the population and the single cell level of two genomic loci in mTEC: the casein gene locus and the Gad67 locus. For both loci, mechanisms of regulation were directly compared between mTEC subpopulations and the corresponding tissue. We focused on epigenetic regulation mechanisms such as histone tail modifications and certain aspects of nuclear structure, both were analyzed in the casein gene locus. In the Gad67 locus we analyzed allele specific and gene co-expression patterns in a Gad67/eGFP knock in mouse model in addition to epigenetic modifications. We found the expression of Casein beta (Csnb) to correlate both with chromatin decompaction and active histone modifications. Gad67 expression equally correlated with active histone modifications. However, the types of histone modifications differed between Gad67 and Csnb, which is an unusual gene in the casein locus as it is expressed at a particularly high frequency. In the Gad67 locus we additionally performed single cell expression analysis. We found significant discrepancies between protein and mRNA frequencies in the case of TRA. On the basis of these findings we propose a three-step model for the epigenetic opening of the Csnb gene: First, DNA demethylation takes place followed by chromatin decompaction and the introduction of active histone modifications. Furthermore, the discrepancies found between protein and mRNA expression frequency in the case of TRA let us assume that pGE fluctuates in individual cells. This concept potentially increases the diversity of antigen expression in the microenvironment in the thymus and thus may be crucial for the induction of T cell tolerance.

Translation of abstract (German)

Die Unterscheidung zwischen Selbst und Fremd (Selbsttoleranz) ist eine grundlegende Eigenschaft des Immunsystems. Die Induktion von Selbsttoleranz beruht auf verschiedenen Mechanismen, die sowohl im Thymus (zentrale Toleranz) als auch in peripheren lymphoiden und nicht-lymphoiden Organen (periphere Toleranz) wirksam sind. Die zentrale Toleranz, also die Selbsttoleranz des heranreifenden T-Zell Repertoires, wird durch negative Selektion sowie durch Induktion von regulatorischen T Zellen (Treg) im Thymus vermittelt. Dies geschieht durch TCR/MHC-Peptid Kontakte zwischen Thymozyten und antigenpräsentierenden Zellen (APC). Die Bandbreite der zentralen Toleranz wird unter anderem durch die Expression gewebsspezifischer Antigene (TRA) durch medulläre Thymusepithelzellen (mTEC) bestimmt. Dieser Prozess wird promiske Genexpression (pGE) genannt. Die pGE umfasst die ektopische Expression von TRA aus quasi allen Geweben des Körpers innerhalb der mTEC Population. Der Prozess der Toleranzinduktion für TRA wurde in den letzten Jahren besser verstanden, die molekularen Mechanismen jedoch, welche pGE in mTEC regulieren, sind noch weitgehend unbekannt. Der größte Anteil der TRA ist in der reifen CD80hoch mTEC Population (mTEChigh)exprimiert, allerdings sind die Expressionmuster in mTEChigh auf Einzelzellebene stark heterogen. Nur 1-15% der mTEChigh exprimieren ein bestimmtes Antigen und es wurde gezeigt, dass die Koexpressionsmuster auf Einzellzellebene stochastisch sind. Ein Charakteristikum promisk exprimierter Gene ist ihre Kolokalisation in chromosomalen Clustern, was für die Beteiligung epigenetischer Mechanismen an dieser unorthodoxen Genregulation spricht. Um die Regulation solch geclusterter Genexpression besser zu verstehen wurde exemplarisch die epigenetische Regulation von pGE auf der Populations- und auf der Einzelzellebene in zweiverschiedenen Loci untersucht: im Kasein-Genlocus und im Gad67 Locus. In beiden Loci wurden die Regulationsmechanismen zwischen mTEC Subpopulationen und dem entsprechenden Gewebe verglichen. Der Fokus lag hierbei auf epigenetischen Regulationsmechanismen wie zum Beispiel istonmodifikationen und bestimmten Aspekten der Kernstruktur. Beides wurde im Kaseinlocus analysiert. Im Gad67 Locus wurden Allel-spezifische und Gen-spezifische Ko-expressionsmuster an Hand einer Gad67/eGFP knock in Maus untersucht, zusätzlich wurden Analysen von epigenetischen Modifikationen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl die Expression von Kasein beta (Csnb) als auch von Gad67 mit epigenetischen Parametern korreliert, jedoch spielen jeweils verschiedene aktive Histonmodifikationen eine Rolle. Auch eine Lockerung der Chromatinstruktur spielt für die Expression von Csnb, welches auf Grund seiner besonders häufigen Expression eine Ausnahmeposition innerhalb des Kaseinlocus einnimmt, eine Rolle. Im Gad67 Locus wurden zusätzlich Einzelzell- Expressionsanalysen durchgeführt, welche eine starke Abweichung zwischen mRNA- und Protein- Frequenz in TRA zeigen konnten. Auf der Basis dieser Ergebnisse schlagen wir ein dreischrittiges Modell für die epigenetische Öffnung des Csnb Locus vor: Zuerst findet DNA Demethylierung statt, gefolgt von einer Dekompaktierung des Chromatins und der aktiven Modifikation von Histonen. Weiterhin legen die starken Abweichungen zwischen mRNA- und Protein-Frequenz für TRA auf Einzelzellebene nahe, dass das Repertoire der pGE auf Einzelzellebene fluktuiert. Diese Eigenschaft erhöht potentiell die Diversität der Antigenexpression im Mikroenvironment im Thymus und ist somit vermutlich essentiell für die Induktion von T Zell Toleranz.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hämmerling, Prof. Dr. Günter
Date of thesis defense: 29 October 2009
Date Deposited: 03 Nov 2009 13:08
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Epigenetik, Immuntoleranz, Thymus, Genexpression
Uncontrolled Keywords: promiske Genexpressionpromiscuous gene expression
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