In der vorliegenden Arbeit wird die Komplexbildung von Cm(III) und Eu(III) mit BTP- und BTBP-Liganden, welche als potentielle Extraktionsmittel zur technischen Umsetzung des SANEX-Prozesses im Rahmen der Partitioning & Transmutation-Strategie diskutiert werden, untersucht. Beide Ligandenklassen vermögen trivalente minore Actiniden selektiv in Gegenwart von Lanthaniden zu extrahieren, die Ursache ihrer Selektivität ist jedoch bisher weitgehend unverstanden. Ziel der Arbeit ist es, die Komplexbildung von BTP- und BTBP-Liganden mit trivalenten minoren Actiniden und Lanthaniden unter prozessrelevanten Bedingungen zu unter¬suchen und hieraus bedeutende Erkenntnisse über die Triebkraft der Selektivität auf molekularer Ebene zu erhalten. Die spektroskopische Quantifizierung der Komplexspezies in Lösung erfolgte mittels der zeitaufgelösten Laserfluoreszenzspektroskopie (TRLFS), welche für die verwendeten Metall¬ionen Cm(III) und Eu(III) eine hochempfindliche und selektive Speziationsmethode darstellt. Anhand von spektroskopischen Untersuchungen zur Komplexierung von n-Pr-BTP in 1 Octanol wurde gezeigt, dass die Stabilitätskonstanten der extraktionsrelevanten 1:3-Komplexe im Falle des Cm(III) fünf Größenordnungen höher sind als die der entsprechenden Eu(III)-Komplexe, worin sich die Selektivität der Liganden bezüglich der Extraktion widerspiegelt. Anhand von Untersuchungen zur Komplexbildung im Wasser-Methanol-Gemisch wurden die höheren Stabilitätskonstanten auf Unter¬schiede in der Reaktionsenthalpie (ΔH) zurückgeführt. Erstmalig wurde der Einfluss elektronischer Parameter SANEX-relevanter Liganden auf Extraktion und Komplex¬bildung gezielt untersucht. Hierzu wurde n-Pr-BTP mit einer Methoxy- beziehungsweise Chlorofunktion in 4-Position derivatisiert. Die Basizität der Liganden steigt hierbei mit der Elektronendichte im aromatischen System an. Es wurde gezeigt, dass die Erhöhung der Basizität sowohl mit der Erhöhung der Stabilitätskonstan¬ten der 1:3-Komplexe als auch mit höheren Verteilungsverhältnissen und Trennfaktoren bezüglich der Extraktion einhergeht. Im Falle der Komplexierung von Cm(III) und Eu(III) mit BTBP-Liganden in 1-Octanol weisen die Stabilitätskonstanten der extraktionsrelevanten 1:2 Komplexe im Falle des Cm(III) um eine Größenordnung höhere Stabilitätskonstanten als die entsprechenden Eu(III)-Komplexe auf, was die Ursache ihrer Selektivität bezüglich der Extraktion darstellt. Durch Untersuchungen im Wasser-Isopropanol-Gemisch wurden Unterschiede in ΔH als thermodynamische Triebkraft der Selektivität bestimmt. Die erhaltenen Daten korrelieren sehr gut mit experimentell bestimmten Trennfaktoren. Darüberhinaus wurden zwei neue Extraktionsliganden entwickelt, deren Strukturen sich von den BTP-Liganden (CA-BTP) und den BTBP-Liganden (Me-BBTBP) ableiten. CA-BTP stellt hierbei eine bedeutende Entwicklung im Hinblick auf die technische Umsetzung des SANEX-Prozesses dar. Es handelt sich um den ersten unter prozessrelevanten Konditionen hydrolysestabilen selektiven Liganden, dessen schnelle Massentransferkinetik den Einsatz in einem technischen Einsatz ermöglicht. Me-BBTBP stellt dagegen das erste Mitglied einer neuen Ligandenklasse dar, welche nun bezüglich ihrer Extraktions- und Komplexierungseigenschaften weiter untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals durch Untersuchungen zur bevorzugten Komplexbildung von trivalenten Actiniden im Vergleich zu Lanthaniden mit BTP- und BTBP-Liganden unter vergleichbaren, prozessrelevanten Bedingungen wichtige Informationen über die molekulare Ursache der Selektivität dieser Ligandensysteme erhalten werden, die eindeutig auf Unterschiede in der Reaktionsenthalpie zurückgeführt werden kann. Dies stellt einen bedeutenden Baustein zum Verständnis der Selektivität dieser Ligandenklassen dar und ist unverzichtbar für eine Optimierung der Extraktionsmittel im Hinblick auf die zukünftige technische Umsetzung des SANEX-Prozesses.
Die biophysikalische Erforschung von Zellskelettkomponenten verlangt nach speziellen Techniken zur Messung von Kräften im Bereich von Pikonewton bis Milinewton. Bislang fehlte eine zufriedenstellende Methode zur parallelen Messung einer großen Anzahl solcher Kräfte im Sub-Nanonewton-Bereich. Die Verwendung von Feldern aus flexiblen Mikrosäulen (Pillars) würde sich in vielen Experimenten anbieten, scheidet aber meist wegen der limitierten Kraftsensitivität der herstellbaren Polymerpillars aus. In dieser Arbeit wird eine innovative Methode zur Herstellung von Pillarfeldern aus dem Hydrogel Poly-Ethylenglykol (PEG) vorgestellt. Das Elastizitätsmodul des Hydrogels kann durch Variation der Maschenweite in einem vier Größenordnungen umfassenden Bereich eingestellt werden. Dadurch können bei Bedarf sehr flexible Pillars zur Messung von Kräften im Sub-Nanonewtonbereich hergestellt werden. Die Methode erlaubt außerdem eine effektive Biofunktionalisierung der Pillarköpfe bereits im Herstellungsprozess. Ein spezieller Kalibrationsaufbau ermöglicht die Kreuzkalibration der Pillars gegen einen Atomkraftmikroskop-Cantilever mit bekannter Federkonstanten. Dadurch können Pillars mit Federkonstanten von minimal 0,3 nN/μm kalibriert werden, was bei Standardmikroskopen einer Kraftauflösung von 30 pN entspricht. Die Möglichkeiten der PEG-Pillar- echnologie werden durch in-vitro-Assemblierung von Mitosespindeln an den Pillarköpfen demonstriert. Bei geeigneten Versuchsbedingungen fusionieren diese Mitosespindeln und üben Kräfte aufeinander aus. Die wirkenden Kräfte führen zu einer Pillarverbiegung und lassen sich dadurch quantifizieren.
Die Phytosphäre stellt mit einem globalen Anteil von 60%, die wichtigste Quelle atmosphärischen Wasserdampfs dar. Dennoch sind die Kopplungsprozesse zwischen Troposphäre und Phytosphäre auf allen Skalen bis zum einzelnen Blatt nur unzureichend untersucht und verstanden. Ziel der Arbeit war primär, die Entwicklung und Anwendung neuer, ortsauflösender, optischer Laserhygrometer, um zerstörungsfrei, d.h. ohne Gasprobennahme, direkt über dem Blatt - mit hoher Zeit- und Ortsauflösung - die Struktur und Dynamik der am Blatt anliegenden H2O-Grenzschicht quantitativ zu untersuchen und ihre Abhängigkeit von Windgeschwindigkeit und lichtinduzierter Photosyntheseaktivität des Blattes zu studieren. Neben Telekomlasern bei 1.37µm wurden dafür neue Laserdioden auf der 2.7µm H2O-Grundschwingungsbande verwendet und eingehend hinsichtlich ihrer statischen und dynamischen Spektraleigenschaften charakterisiert. Eine neue softwarebasierte Routine gestattet die anwendungsspezifische Linienauswahl und somit die Leistungsoptimierung der Spektrometer. Zwei Konzepte zur räumlich aufgelösten H2O-Erfassung (mit DC-Verschiebemotoren bzw. Galvanometerscannern) wurden realisiert und eingehend getestet. Für windgeschwindigkeitsabhängige Untersuchungen der H2O-Grenzschicht unter definierten Randbedingungen wurde erstmals ein geschlossener Miniatur-Windkanal für Blätter (Außenmaß 114 x 58 cm, Querschnitt 4 x 5.4 cm) mit homogenen, laminaren Strömungsbedingungen und Geschwindigkeiten von 0.1-6m/s entwickelt, und in Kombination mit dem Scannerhygrometer erfolgreich zur ersten, räumlich aufgelösten Untersuchung der H2O-Grenzschichtdynamik von Blättern (Gattung Epipremnum Pinnatum) eingesetzt. Die Laserhygrometer ermöglichten dabei bei Absorptionsstrecken von nur 4.4 cm H2O-Konzentrationen mit einer Absolutgenauigkeit von 3% und bis zu einer Nachweisgrenze von 4.6 ppm (=204ppb m) zu bestimmen. Verbesserte Auswerteverfahren erreichten eine Zeitauflösung von bis zu 3ms je Ortspunkt. In Verbindung mit dem Scannerhygrometer ermöglichte dies erstmals, räumlich aufgelöste 2D-Konzentrationsfelder am Einzelblatt (Abstandsbereich bis 16mm vom Blatt) mit einer Ortsauflösung von 0.18mm zu vermessen. Die Erfassung eines Feldes mit 87 Ortspunkten dauerte dabei nur 18s. Hiermit gelang es windgeschwindigkeitsabhängige Grenzschichtdicken von 3.5-7.5mm zu erfassen und unter Anwendung des Fick'schen Gesetzes erstmals bei intakter Blattgrenzschicht physiologisch relevante H2O-Flussraten von 0.17mmol m^-2 s^-1 durch die blattnahe Grenzschicht zu ermitteln. Der modulare Aufbau des neuartigen Systems erlaubt in Zukunft durch die schon vorbereitete Kombination mit Thermographie- und Chlorophyllfluoreszenzmessmethoden weitere, bisher nicht mögliche Einblicke in die Blatttranspiration, Grenzschichtdynamik, und deren Kopplung an den Photosyntheseapparat.
In this work, the influence of environmental parameters on cellular behavior has been investigated. Therefore, an artifcial substrate system, according to the biophysical and biochemical properties of the extracellular matrix in connective tissues, has been developed. The Young’s moduli E of poly(ethylene glycol)-diacrylate (PEG-DA) substrates span more than four orders of magnitude (0.6 kPa < E < 6 MPa). Since PEG-DA substrates are protein repellent, they were decorated by quasi hexagonally ordered, extended gold nanoparticle arrays, manufactured by block copolymer micellar nanolithography (BCMN). To provide bioactivity in terms of cell adhesion c(RGDfK) peptide, which is specific for alphaV beta3 integrins, was immobilized on the nanoparticles. The interparticle spacing and, hence, spacing of integrin binding sites L could be precisely tuned, independently of the substrate rigidity, between 20 nm and 160 nm. We investigated the behavior of fibroblasts as a function of changes within this two-dimensional parameters space (L; E ). To this end, cell spreading area and cell-substrate interaction forces were determined by phase contrast microscopy and single cell force spectroscopy (SCFS), respectively. The experiments revealed two tactile set points, thresholds in cellular sensing behavior, at E = 8 kPa and L = 70 nm, after 6, 12, and 24 hours of adhesion, respectively. Moreover, according to the hierarchical phase model in cellular behavior, elasticity was identified to be the dominant parameter in cellular sensing processes. Thus, this work provides an important contribution to the understanding of cell-cell and cell-matrix adhesion.
Um die Chemie auf Siliziumeinkristalloberflächen zu untersuchen wurden diese sowohl mit verschiedenen anorganischen Atommonolagen als auch mit organischen Submonolagen terminiert und mit spektroskopischen und massenspektrometrischen Methoden charakterisiert. Zunächst wurden die Anbindungsreaktionen der untersuchten Terminierungen mittels FTIR-Spektroskopie analysiert und optimiert. Die weitere Charakterisierung erfolgte mittels laserinduzierter thermischer Desorption (LITD), Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) und spektroskopischer Ellipsometrie (SE). Zu den untersuchten Funktionalisierungen zählten die anorganischen wasserstoff- (Si(111):H) und halogenterminierten (Si(111):Cl, :Br, :I) Oberflächen sowie die organischen silylierten und methylterminierten(Si(111):CH3) Oberflächen. Erstmals gelang die Herstellung halogen- und methylterminierter Oberflächen mittels konventioneller Schutzgaschemie im Schlenk-Kolben. Eine photochemische Umsetzung der Si(111):H-Oberfläche mit den jeweiligen Dihalogengasen führte in Form einer radikalischen Substitution zur entsprechenden halogenierten Oberfläche. Eine nucleophile Substitution der Si(111):Cl-Funktionalität mit einem Grignard-Reagenz (CH3MgCl) endete in der methylierten Si(111):CH3-Oberfläche. Die mittels LITD ermittelten Flugzeitmassenspektren belegen die erfolgreiche Oberflächenanbindung der jeweiligen Halogene und der Methylgruppe. Die Halogene desorbierten atomar und mit steigender Elektronegativität als SiXn-Cluster, was zu einer Aufrauung der Oberfläche führte. Die Methylgruppen desorbierten sowohl als Methylfragmente als auch assoziativ in Form von Ethyl- und Propylfragmenten. Die zur Auswertung der LITD-Massenspektren benötigte Desorptionstemperatur wurde aus der numerischen Anpassung der gemessenen Flugzeitverteilungen der Si(111):H- und Si(111):CH3-Oberflächen ermittelt. Die Rechenroutine passte gleichzeitig vier, bei unterschiedlicher Laserfluenz gemessene,Desorptionsspektren an. Die Oberflächentemperatur bei der Desorption konnte mit einer Genauigkeit von ± 15 K abgeschätzt werden. Bei den organischen silylierten Terminierungen handelte es sich um Dialkyl und Diarylsilylfunktionalisierungen des Typs -R2SiH (R = Me, i-Pr, t-Bu, Ph). Eine Kondensationsreaktion mit den Silanolgruppen der natürlichen Oxidschicht der Siliziumoberfläche führte zur Ausbildung der Submonolagen. Die freie SiHFunktionalität zeichnete diese Oberflächenmodifikationen aus. Zum einen konnte die Lage ihrer Schwingungsbanden berechnet und zum anderen die selektive Oxidation in einer wässrigen KMnO4-Lösung zur SiOH-Gruppe erzielt werden. Diese an der Oberflächenfunktionalisierung neu gebildete Ankergruppe ermöglichte unter Ausbildung einer Siloxanbrücke die Anbindung eines weiteren Dialkyl- bzw. Diarylsilylbausteins. So war es möglich, auf der Siliziumoberfläche gezielt Siloxanketten wachsen zu lassen. Diese schrittweise eindimensionale bottom-up-Synthese wurde mit vier voneinander unabhängigen Methoden nachgewiesen: ATR-FTIR-Spektroskopie, XPS, SE und Kontaktwinkelmessungen.
A new class of model cell membranes which is separated from the solid substrate via linear polymer spacers of defined length was established in order to unravel the physical role of soft polymers attached to the membrane surface (e.g. glycocalyx) in modulating cell-cell interactions. Using specular neutron and X-ray reflectometry as well as ellipsometry the influence of the lateral density and length of the polymer chains on the membrane-substrate interactions was systematically investigated. The combination of different reflectivity techniques at various osmotic pressures and in bulk water enabled the calculation of quantitative force-distance relationships which reveal the interplay of the major interfacial forces determining the equilibrium distance. During the transfer of lipid-lipopolymer monolayers from the air-water interface to solid substrates by vertical lifting, stripe patterns parallel to the transfer direction appear. A deeper insight into the pattern formation process is taken by two uniquely designed experimental setups that allow for the in situ observation of phase separation during film transfer. The dependence of the characteristic length on the preparation parameters was systematically discussed in the theoretical framework of phase separation: In fact, the experimental results at low transfer speeds could be well explained with the Cahn-Hilliard equation.
All cells in our body are surrounded by Extra Cellular Matrix (ECM), from which they derive biochemical, structural and mechanical signals. One of the main fibrillar ECM protein components is Fibronectin (Fn), which is believed to act as a mechanochemical signal transducer. A current hypothesis is that Fn can undergo structural transitions upon stretching, which can alter Fn binding site accessibility and ultimately lead to an adapted cell response. While this hypothesis has existed for several years, the lack of suitable model systems prevented its proof. The aim of this work was to (i) produce regular arrays of Fn nanofibrils, (ii) control the alignment, diameter and tensile state of those nanofibrils, and (iii) to determine their structural and mechanical properties. During this work, a new method to create regular arrays of Fn nanofibrils was developed. This method allows the control of nanofibril directionality and diameter and can also be used to produce nanofibrils from other ECM proteins, such as Laminin (LM) and Collagen (COL). The method depends both on a protein’s ability to accumulate at the air-buffer interface and its ability to self-associate. The production of nanofibrils from various polymers that share these properties is thus possible. The resulting nanofibrillar arrays can be produced on a variety of mirostructured materials, ranging from Silicon over Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) to Polyurethane (PU). The biofunctionality of different ECM nanofibrillar arrays was demonstrated by specific cell adhesion after nanofibril transfer onto non-fouling Polyethyleneglycol (PEG) hydrogels. An investigation of both the molecular structure and the mechanical properties of Fn nanofibrils was performed by Förster Resonance Energy Transfer (FRET) and Atomic Force Microscopy (AFM) experiments. Fn molecules form a surface film after application of Fn into a drop of Phosphate Buffered Saline (PBS). FRET analysis of Fn was performed to determine the degree of Fn molecular unfolding. It could be shown that Fn within surface films only unfolds upon surface dewetting, which coincides with nanofibril formation. The produced nanofibrils show an elongation at break of 200 %. Ruptured nanofibrils retract to 30 % of their original length, but the Fn molecules within nanofibrils do not re-fold completely, as derived from FRET measurements. The pre-strained Fn nanofibrils display a high effective Young’s modulus of E ~ 0.1 - 6 GPa, as determined by AFM experiments. In summary, the production, control and characterization of novel ECM models was accomplished in this work, which can be used to investigate cell adhesive response.
Subject of this thesis is the theoretical study of the quantum properties of ultracold Rydberg atoms in the presence of inhomogeneous external fields. Using the Ioffe-Pritchard configuration as a key ingredient superimposed by a homogeneous electric field, we demonstrate that trapped Rydberg atoms can be created in long-lived circular states exhibiting a permanent electric dipole moment of several hundred Debye. The resulting dipole-dipole interaction in conjunction with the radial confinement is demonstrated to entail an effectively one-dimensional Rydberg gas with a macroscopic interparticle distance. Turning our investigations to the low angular momentum electronic states, we demonstrate that the two-body character of Rydberg atoms significantly alters their trapping properties opposed to point-like particles with identical magnetic moment. Analytical expressions describing the resulting trapping potentials are derived and their validity is confirmed by comparison with the numerical solutions of the underlying Schrödinger equation. The center of mass dynamics are studied by means of an adiabatic approach and implications for quantum information protocols involving magnetically trapped Rydberg atoms are discussed. We conclude by demonstrating how the specific signatures of the Rydberg trapping potential can be probed by means of ground state atoms that are off-resonantly coupled to the Rydberg state via a two-photon laser transition.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Wechselwirkung dreiwertiger Actiniden und Lanthaniden mit Ca2+-haltigen Mineralphasen untersucht. Als Hauptuntersuchungsmethode diente die site-selektive zeitaufgelöste Laser-Fluoreszenzspektroskopie (engl.: time-resolved laser fuorescence spectroscopy, TRLFS). Mit Hilfe dieser Methode konnten insgesamt 19 Eu3+- und Cm3+-Spezies in acht verschiedenen Mineralphasen identifiziert und weitgehend charakterisiert werden. Aus den Beobachtungen in verschiedenen Systemen konnten zudem Mechanismen und Einflussgrößen abgeleitet werden, die die Sorptions- und Einbauprozesse steuern. Stets handelt es sich um direkt auf den spektroskopischen Daten beruhende Schlussfolgerungen, die ein molekulares Prozessverständnis ermöglichen. Auf diese Weise tragen die gewonnenen Erkenntnisse zur Verlässlichkeit eines Langzeitsicherheitsnachweises für ein Endlager für radioaktive Abfälle bei. Der Fokus der Studien lag auf der Bildung von "solid solutions" dem strukturellen Einbau eines Gastions in ein Wirtsgitter. Dieser Prozess ist von besonderem Interesse, da er bisher kaum untersucht, und daher auch kaum für Sicherheitsanalysen berücksichtigt ist. Trotz dieser Vernachlässigung stellt der strukturelle Einbau allerdings einen hocheffizienten Retardierungsmechanimus dar. Eine Remobilisierung des Actinids erfolgt bei Auflösung des Wirtskristalls oder wenn die Actinidkonzentration in der umgebenden Lösung unter einen bestimmten Wert absinkt. Somit wäre zur Remobilisierung eine drastische Änderung im geochemischen Milieu notwendig. Zudem ist die Bildung von "solid solutions" ein entropischer günstiger Prozess, der thermodynamisch favorisiert sein kann, wenn der mit der Bildung einhergehende Enthalpieverlust klein ist. Die Enthalpieänderung des Systems hängt zum einen von der im System induzierten Gitterspannung, also im Wesentlichen vom Verhältnis der Ionenradien von Gast- und Wirtsion und der Flexibilität des Gitters ab. Andererseits muss die Koordinationssphäre des Gastions durch diejenige des Kristallgitters ersetzt werden. Die durch die Gitterspannung verursachte positive Enthalpie ist für die untersuchten (und für das Endlager relevanten) verdünnten "solid solutions" bei günstigem Verhältnis der Ionenradien von Gast- und Wirtskation gering. Dies ist gegeben, da die Ionenradien von Cm3+ und Ca2+ nahezu identisch sind und die Konzentrationen der Gastkationen stets unter 1000ppm bleiben (im Falle des Cm3+ sogar unter 10ppm). Die Untersuchung der Ligandenaustauschkomponente der Enthalpie ist ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit. Die untersuchten Mineralphasen sind Calcit, Aragonit und Vaterit CaCO3, sowie Gips CaSO4 2H2O, Fluorit CaF2, Apatit Ca5(PO4)3(OH, F), Powellit CaMoO4 sowie ein Ca2+/Eu3+-substituierter Sodalith der Zusammensetzung (Ca7,5Eu0,5)(OH)8 (Al8,5Si3,5O24). Alle zeigen Wechselwirkung mit den dreiwertigen Actiniden und Lanthaniden, die sich in ihrer jeweiligen Ausprägung jedoch unterscheiden. Bis auf Gips, zeigen alle Minerale die Bildung von "solid solutions", der Prozess ist aber nicht in allen Fällen identisch.
In this thesis, the structure and dynamics of model membranes are probed using a combination of experiments and simulations. The lateral diffusion of prion proteins (PrPc) coupled to lipid headgroups in planar lipid membranes (supported membranes) are investigated in Chapter 5 using a self-constructed single-molecule fluorescence microscope. Using random walk simulations, molecular variations of the PrP were detected by their influence on the lateral diffusion. In order to improve understanding of archaea survival under extreme conditions, archaea-mimetic lipids and membranes are investigated in Chapter 6. The structure, ordering, and lateral diffusion of these cyclic transmembrane lipids are investigated by optical and X-ray scattering techniques. In Chapter 7, molecular dynamics (MD) simulations are used to study membranes of conventional phospholipids and unique cyclic lipids on the level of atomic detail, showing excellent agreement with the experimental findings. An optimized representation of the ordered gel phase allows for the first successful simulation of first order melting transitions. Thus, the combination of optical techniques in real space and scattering experiments in reciprocal space with complementary computer simulations is a powerful tool to unravel the ordering and dynamics of biological systems in different length and time scales.
In all subdiffraction fluorescence microscopy techniques, the theoretically infinite attainable resolution is, in practice, limited by the photobleaching of fluorophores. Repetitive scans of the sample required for e.g. three dimensional recordings, increase photobleaching, dark state transitions and, in case of living cells, phototoxicity. To advance such experiments all possibilities to reduce the photobleaching must be explored. In this thesis, various chemical and physical approaches to tackle photobleaching are studied within the context of stimulated emission depletion (STED) microscopy, which is the first and most prominent method for subdiffraction imaging. The STED setup constructed for this purpose allows for the fast adaptation to new fluorescent dyes, and relies on a novel adaptive spectral and phase filter technique. Furthermore, the optical setup facilitates a gentle exposure strategy, in which the time that the dye is irradiated is significantly reduced. Three-dimensional images can therefore be recorded, and the palette of applicable dyes can be expanded to the blue-green regime by the so far unemployed coumarin derivatives, which are known to be prone to photobleaching. The label itself is another vantage point from which photobleaching limitations in subdiffraction microscopy can be circumvented. For the first time, light-driven modulation of the fluorescence from Mn-doped ZnSe quantum nanocrystals has been established through excited-state absorption (ESA). This enables a new type of far-field fluorescence microscopy with diffraction-unlimited resolution based on quantum dots, which are well known for their superior photostability. The correct sample embedding in the refractive index matching is also of high importance, if spherical aberrations and light scattering are to be minimized to optimize the fluorescence collection. For this purpose, an embedding medium, 2,2´-thiodiethanol (TDE) is introduced, which, by being miscible with water at any ratio, allows for refractive index matching up to that of immersion oil and making high resolution recordings deep within the sample feasible.
Eine Weiterentwicklung des SNAP-Tag Systems wurde erfolgreich eingesetzt, um das Chemotaxis Protein CheY in lebenden E. coli Bakterien hochspezifisch mit dem Farbstoff MR121 zu markieren. Unter Ausnutzung der Fluoreszenzlöschung des MR121 durch das Substrat Benzylguanin konnte die unspezifische Hintergrundfluoreszenz in lebenden Bakterien durch nicht gebundene Fluorophore um mehr als 90 % reduziert werden. Diese Reduktion ist ein sehr wichtiger Schritt im Hinblick auf die Anwendbarkeit hochspezialisierter fluoreszenzmikroskopischer Techniken und macht den SNAP-Tag zu einer sehr guten Alternative zu den fluoreszierenden Proteinen, deren mangelnde Photostabilität oftmals Einzelmolekülstudien entgegen steht. Unter Anwendung der bildgebenden Diffusionsmikroskopie (DIFIM) war es möglich, die Diffusionszeit des CheY innerhalb lebender E. coli Bakterien zu bestimmen und Heterogenitäten in verschiedenen Bereichen in den Zellen zu aufzulösen. Mit der Chemotaxis, die die Bewegung der Bakterien steuert, konnte mit dieser Methode erstmals eine biologisch hochrelevante Fragestellung bearbeitet werden. Zusätzliche Standard-FCS-Messungen in wässrigen Proteinlösungen in physiologischen Konzentrationsbereichen können zu einer Eichung der erhaltenen Diffusionszeiten dienen und somit die Interpretation von Messungen in biologischen Proben erleichtern. Untersuchungen der spektroskopischen Eigenschaften von Quantum Dots zeigten, dass auch sie grundsätzlich dazu genutzt werden können, intelligente, fluoreszenzgelöschte Sondensysteme zu entwickeln.
Stimulation of vascular cells by extracellullar signals Treatment of vascular diseases often requires the selective addressing of endothelial (ECs) and smooth muscle cells (SMCs). The two vascular cell types are important for the wound healing after stent implantation. Recent research designs new materials and coatings for stents to improve the complex healing process. The aim of my work was to find and investigate different reactions in the two vascular cell types (ECs and SMCs) through surface chemistry, topography and other stimulating factors like electrical fields or applied external stretching forces. On various iridium-oxide stent coatings ECs seem to be more sensitive to chemical differences than SMCs. On PDMS micro-nano-grooves ECs and SMCs align not significant differently to the structure. Cell assays on nano-structured and bio-functionalized surfaces reveal a universal ligand distance dependency for both cell types. Upon application of uniaxial mechanical stretch or an directed electrical field, ECs and SMCs show significant different responses. General characteristics of the two cell types can be quantitatively described by an automatic controller model. These findings are promising for further studies to improve wound healing after implantation and even more to allow the artificial generation of new blood vessels (angiogenesis).
Entwicklung, Bau und Test einer UHV Röntgenstreukammer für die digitale In-Line Holographie Digitale In-Line Holographie ist ein linsenloses Verfahren, bei dem ein Pinhole aus einer kohärenten Lichtquelle eine Kugelwelle generiert, die von der zu untersuchenden Probe teilweise gestreut wird. Diese gestreuten Photonen interferieren dann auf einem digitalen CCD-Detektor mit der ursprünglichen Kugelwelle. Die Rekonstruktion dieser Interferenzmuster erfolgt mittels Kirchhoff-Helmholtz-Transformation. Dieses Verfahren kann nicht nur mit sichtbarem Licht, sondern auch mit Photonen in UV- und VUV-Bereich angewendet werden. Biologisch besonders interessant ist in diesem Bereich das Wasserfenster bei Wellenlängen von 2,3 nm bis 4,4 nm. In dieser Arbeit wurde eine Ultrahochvakuum Streukammer entwickelt, um mit Synchrotronstrahlung solche Messungen durchführen zu können. Dabei wurde ein thermisch stabilisierter optischer Tisch im Vakuum realisiert, auf dem sich 13 motorisierte Achsen befinden, um Pinhole, Probe und Kamera gegeneinander zu verfahren. Zusätzlich ist die tomographische Aufnahme von Proben möglich. Erste Ergebnisse demonstrieren die Leistungsfähigkeit der neuen Apparatur an verschiedenen Strahlungsquellen wie BESSY und FLASH mit unterschiedlichen biologischen Proben. Es konnte nicht nur gezeigt werden, dass Strahlenschäden momentan nicht der limitierende Faktor der Holographie sind, sondern es wurde auch die bislang höchste Auflösung mit digitaler In-Line Holographie erreicht, und erstmals materialspezifischer Kontrast in Zellkernen gezeigt. Außerdem wurden mit der neuen Apparatur erste Tomographieexperimente durchgeführt und Proben mit Kohärenter Röntgenstreuung aufgenommen.
In der vorliegenden Arbeit wurden flugzeuggetragene Messungen im Rahmen des "HOx OVer EuRope Projekts" (HOOVER) durchgeführt, welches dazu ausgelegt war, die saisonale Variation und räumliche Verteilung wichtiger troposphärischer Spurengase über Europa zu charakterisieren. In zwei Messzeiträumen im Oktober 2006 und Juli 2007 konnten Mischungsverhältnisse von Wasserstoffperoxid, Methylhydroperoxid und Formaldehyd von 40°N bis 75°N gemessen werden. Das nasschemische Verfahren zum Messen der Hydroperoxide basiert auf Fluoreszenzspektroskopie. Nach dem Überführen der Spezies von der Gas- in die Flüssigphase folgt eine enzymatische Derivatisierung der Peroxide und nachfolgend die Detektion der entstandenen Fluoreszenzfarbstoffe. Zum Umfang dieser Arbeit gehörte der Aufbau eines Einlasssystems zum Generieren eines konstanten Vordrucks für das Peroxidinstrument sowie die Modifikation und Instandhaltung des eigentlichen Messgerätes. Um Ansprüchen an zukünftige flugzeugbasierte Messkampagnen auf dem Forschungsflugzeug HALO zu entsprechen, wurde darüber hinaus ein neues Messgerät geplant und aufgebaut. Hydroperoxide und Formaldehyd haben einen signifikanten Einfluss auf das Budget von HOx (HO2+OH), den Hauptoxidantien der Troposphäre und damit auf die Selbstreinigungskraft unserer Atmosphäre. Die Analyse der gemessenen Profile zeigt für die Peroxide und das Formaldehyd eine Abnahme mit der Höhe und der Breite. Der Mittelmeerraum nimmt eine Sonderrolle in Europa ein, mit den jeweils höchsten Mischungsverhältnissen für die hier besprochenen Spezies. Ein Vergleich der Messungen mit den globalen Computermodellen MATCH-MPIC und EMAC zeigt eine gute Reproduktion der Trends innerhalb der Modelle, deckt aber auch signifikante Schwächen in der Reproduktion der absoluten Mischungsverhältnisse auf. Eine Sensitivitätsstudie mit EMAC zeigt das Auswaschen von Wasserstoffperoxid als eine potentielle Schwachstelle im Modell auf und demonstriert den Einfluss der Peroxide auf das Budget von HOx.
Optical tweezers are a versatile tool to apply and measure forces in the piconewton range on microscopic ob jects that are held by optical forces in a focussed laser beam. We employed holographic optical tweezers (HOT) to create extended force sensor arrays, consisting of multiple trapped particles that were controlled and probed individually. The combination of high-speed video microscopy with fluorescence imaging allowed the visualization of labeled protein structures in parallel with the tracking of multiple trapped particles for force measurements. Using this setup, we could perform quantitative force measurements on biological samples with HOT for the first time. To obtain reliable force measurements, calibration methods based on power spectra analysis were adapted for holographic optical tweezers. In microfluidic environments, biomimetic structures of the cellular cytoskeleton could be reconstituted between optically trapped microspheres. Flow cells and fluidic control, developed in this work allowed the exchange of solutions in the system and thus, the complete control of the chemical environment without generating forces that would affect the trapped particles. This provided the possibility to measure dynamic processes such as the contractility of two-dimensional cross-linked actin networks in the microfluidic flow cell. A network of actin fibers between seven trapped particles was created and the forces during cross-linking were obtained. To investigate bundling processes between filaments, a method has been established using dynamic HOT to manipulate zipper-like structures between trapped particles actively. Analysis of particle trajectories during zipping of filaments allowed the determination of binding energies between filaments. Unbundling forces between actin filaments were measured on trapped spheres during the active process of unzipping. Additionally, this system was transferred to actin networks on PDMS micropillar substrates to improve feasibility. In combination with the optical trap, this allowed for the investigation of unbundling forces for alpha-actinin as well as for magnesium ions as cross-linkers. In a different set of experiments, the adhesion process of the Malaria causing parasite Plasmodium was investigated. Adhesion and locomotion of the sporozoites is crucial for the infectivity of the parasite. A methodology for laser tweezer experiments with Plasmodium sporozoites was developed. Using optical tweezers, the formation of adhesion sites in the presence of actin disrupting drugs was probed and compared to knock-out parasite strains. We found the second step of sporozoite adhesion sequence to be significantly dependend on actin and a specific transmembrane protein named TRAP.
Microstructured interfaces such as micropillars made of polydimethyl-siloxane (PDMS) provide a novel approach both as topologically defined, force sensing substrates in cell culture as well as scaffolds for biomimetic protein assays. This work is divided into two parts. In the first part, PDMS micropillar arrays functionalized with fibronectin, are applied as a biomechanical microenvironment for immortalized human gingival keratinocytes (IHGKs) and gingival connective-tissue fibroblasts (GCTFs). IHGKs and GCTFs show successful adhesion and growth on the pillar heads and exert forces up to about 110 nN in the case of IHGKs and about 174 nN for GCTFs. Varying the interpillar distances affects the early keratinocyte differentiation and morphology. At decreasing inter-pillar distances the IHGKs show an increased keratin 1 (K1) extension in the cytoplasm, increased mRNA transcription of keratin 1 and a shape change from a more linear to a more round form. A novel GCTF-IHGK co-culture system is developed as a model of the epithelial tissue, to study explicitly the role of the GCTFs in the morphogenesis of the derived epithelial equivalents. The epithelial equivalents, cultured for 7 and 14 days on GCTF-populated pillar arrays, are found more similar to the in vivo phenotype than the GCTF-free cultures. These findings are confirmed by following the mRNA transcription levels for keratin 1. A novel, transparent microfluidic platform, based on PDMS pillars is developed in the second part of this work. It is designed to investigate actin cortex models and to provide control over the physicochemical environment, allowing simultaneous high resolution fluorescence microscopy. The formation of crosslinking networks is observed using various crosslinkers, such as filamin, myosin II, alpha-actinin and magnesium ions. Dependent of the geometric configuration of the actin filaments anchored to the pillar tops, so-called zipping crosslinks are observed. The zipping velocity is both influenced by the flow speed, as well as the number and the configuration of the filaments involved in the process. It is found to range between 2 - 15 µm/s. To further quantify the crosslinking process, the flow-cell is combined with an optical tweezers system. The unzipping forces are measured for the crosslinkers alpha-actinin and magnesium ions. Forces of about 17 - 20 pN are derived for magnesium ions and about 30-45 pN for alpha-actinin.
Diese Arbeit widmet sich der Anwendung der in den letzten Jahren entwickelten Bildgebenden Diffusionsmikroskopie (DIFIM) auf lebende Zellen. Die Methode erlaubt die Detektion von Intensitätsfluktuationen über einen großen, mehrere Mikrometer umfassenden Bereich. Sie ermöglicht zugleich die Diskriminierung des Fluoreszenzsignals von störender Hintergrundfluoreszenz anhand von Fluoreszenzlebensdauermessungen. DIFIM wurde an einem Testsystem in lebenden Zellen, bestehend aus einem farbstoffmarkierten Oligonukleotid, welches an den PolyA-Strang der zelleigenen mRNA hybridisieren kann, untersucht. Es wurde gezeigt, dass es mithilfe von DIFIM möglich ist, unterschiedliche Diffusionszeiten in lebenden Zellen zu visualisieren. Damit wurde der Grundstein gelegt, um Wechselwirkungen verschiedener Proteine innerhalb einer Zelle zu verfolgen. Zur Demonstration der Anwendbarkeit von DIFIM in der Biologie wurde der JAK-STAT-Signalweg genauer untersucht. Im Speziellen sollte die Diffusion des Proteins STAT5b verfolgt werden. Hierfür wurde zunächst die in vivo Markierung des Proteins mit einzelmolekültauglichen, rot fluoreszierenden Farbstoffen untersucht. Zur Markierung wurde ein Fusionsprotein mit dem sogenannten SNAP-Tag eingesetzt, der eine spezifische kovalente Bindung synthetischer Farbstoffe an gewünschte Proteine ermöglicht. Es stellte sich heraus, dass die Markierung mittels Inkubation unspezifisch war, weshalb die Markierung unter Verwendung von Transfektionsreagenzien durchgeführt wurde. Auch diese ermöglichten in lebenden Zellen keine charakteristische Markierung. Weiterführend wurden Zellen mit einem Fusionsprotein aus STAT5b und mCherry, ein Derivat des Rot-Fluoreszierenden Proteins, transfiziert. Derartig behandelte Zellen ermöglichten es erstmals, Unterschiede in Diffusionszeiten in in vivo DIFIM-Messungen zu beobachten.