Every cell of a eukaryotic organism contains the whole genome in a membrane-bound nucleus where the DNA is compacted in highly organized chromatin fibers. The association of DNA with histone proteins allows for efficient packaging of the genetic material. Chromatin is a dynamic polymer that is packed and unwrapped in a highly regulated manner to match the multiple tasks that it encounters during the lifetime of a cell. Regulation of DNA accessibility is achieved by the concerted action of chromatin-associated proteins, such as chromatin remodeling enzymes, variant histone proteins and chromatin modifying enzymes. The latter class of enzymes brings about post-translational modifications of histones. Modifications, such as acetylation, can lead to changes in chromatin structure either directly or by recruiting other effector proteins. A process that is linked to histone acetylation is dosage compensation in the fruit-fly Drosophila melanogaster which is studied as a model system for the regulation of chromatin. The multi-protein complex involved, harbours an enzyme, MOF (males absent on the first), with histone acetyltransferase activity directed towards histone H4 lysine 16. Other proteins that have previously been known to associate with it are the MSL (male specific lethal) proteins. Recent biochemical purification of MOF containing complexes revealed that, in addition to the MSL proteins, a number of novel proteins co-purified with MOF in Drosophila and mammals (Mendjan et al., 2006). During my PhD I was therefore interested to study whether these novel proteins, which we named NSL proteins (non-specific lethal), exist in a complex similar to the MSL proteins in Drosophila and if so, what might be their function. Interestingly, we found that one of the NSL proteins, NSL1 has a very similar domain architecture to MSL-1. A major part of this thesis has therefore been to study the NSL1 protein in detail. Using co-immunoprecipitation as well as in vitro interaction assays, I was able to show that NSL1 indeed interacts directly with MOF. By applying an affinity purification strategy tagging the NSL1 protein, my PhD work has demonstrated that NSL1 co-purifies with other NSL proteins in a complex that is distinct from the MSL complex. I have also been able to show by immunofluoresence microscopy that two components of this complex, NSL1 and MCRS2, co-localise on hundreds of sites on all polytene chromosomes, suggesting that very likely these proteins not only interact biochemically but may also function together in vivo. This part of my work has therefore provided novel insights into the existence of the NSL complex in Drosophila and has showed that MOF associates with two distinct sets of proteins, namely the MSLs and the NSLs. In the second part of my PhD work I studied the overall contribution of MSL and NSL complexes in modulating histone acetylation using quantitative mass spectrometric analysis of endogenous histones from Drosophila cells that were RNAi-depleted of MOF, MSL-1 and NSL1. This work revealed that MOF contributes to a majority of histone H4 K16 acetylation in Drosophila cell lines and that MSL-1 plays an important role in modulating the activity of MOF in vivo. Surprisingly, we did not observe any major changes in histone acetylation levels upon NSL1 depletion in vivo. Interestingly, NSL1 depleted cells displayed cell proliferation and segregation defects. The in vivo function of NSL1 remains elusive. Future work will therefore be required to elucidate the mechanism of action of these novel proteins in Drosophila. The foundations for it were layed by this work.
Die höhere Ordnung der Chromatinorganisation und ihre dynamischen Eigenschaften sind direkt mit Vorgängen wie Genexpression, Replikation, DNA Reparatur und Rekombination verbunden. In dieser Doktorarbeit wurde die Mobilität von Telomeren in einer humanen Osteosarcoma-Zellinie U2OS untersucht, in welche zuvor lacO-Operator Widerholungseinheiten an den Telomeren der Chromosomen 6, 11 und 12 stabil integriert wurden.Die Mobilität dieser drei Telomere wurde während der Interphase mittels Fluoreszenzmikroskopie durch gebundene LacI-Repressoren, welche mit autofluoreszenten GFP oder mRFP1 Domänen fusioniert waren, beobachtet. Durch Messungen der Distanzänderungen zwischen zwei markierten Telomerpaaren mittels Hochgeschwindigkeits-Lebendzellbeobachtung wurde ein begrenztes Diffusionsmodell abgeleitet, welches die Ortsveränderung der Telomere im Zellkern in einer Zeitskala von Millisekunden bis Stunden beschreibt. Drei Arten von Bewegungen wurden identifiziert: (i) Schnelle, lokale Bewegungen im (Milli-)Sekundenbereich mit einer Diffusionskonstante von Dms = 2•10-3 µm2 s-1, welche auf eine Region mit einem Radius von rms ~ 80 nm begrenzt waren, (ii) Bewegungen im Sekunden/Minutenbereich mir Dsec = 4•10-4 µm2 s-1 und rsec = 150 nm und (iii) Bewegungen im Minuten/Stundenbereich mit Dmin = 2•10-5 µm2 s-1. Für die letztgenannten Ortsveränderungen wurden mittlere Begrenzungsradien von rmin = 0.3 ± 0.1 µm bestimmt, wobei ein Anteil von ~ 30% der Telomere eine hohe ausgedehnte Mobilität mit rmin = 0.8 ± 0.4 µm zeigte. Dies legt den Schluss nahe, dass die Mehrheit der Telomere an eine stabile Struktur im Zellkern verankert ist , wogegen sich ein gewisser Anteil der Telomere freier bewegen kann. Darüberhinaus konnten wir zeigen, dass eine Korrelation zwischen einem Teil der Telomere mit kurzen Wiederholungssequenzlängen und Telomeren mit ausgeweiteter Mobilität besteht, was darauf hinweist, dass intakte Telomere zur Verankerung notwendig sind. Zudem wurde die Mobilität von Promyelozytische-Leukämie (PML) - Zellkernkörperchen relativ zu den Telomeren analysiert. Die PML Körperchen formten Komplexe mit den Telomeren in der Telomerase-negativen U2OS Zellinie. Diese wurden schon zuvor beschrieben im Weg einer alternativen Verlängerung von Telomeren (alternative lengthening of telomeres, ALT) involviert zu sein und daher ALT assoziierte PML Körperchen (ALT associated PML bodies, APBs) genannt. Die Dynamik der Bildung von APBs wurde beobachtet. Im Hinblick auf die Unterschiede der Telomermobilität, der Länge der Telomersequenzwiederholungen und ihrer Interaktion mit den PML Körperchen erstellten wir ein Modell zur Beschreibung der Dynamik des ALT Wegs.
Das Urothelkarzinom ist die 4. häufigste Karzinomerkrankung bei Männern und die 6. häufigste bei Frauen. In allen Stadien des Urothelkarzinoms konnte gezeigt werden, dass es zu einer erhöhten Expression der induzierbaren Cyclooxygenase Isoform, COX-2, mit erhöhten Prostaglandinspiegeln kommt. COX-2 wird in den meisten Geweben nicht exprimiert, jedoch in Prozessen der Wundheilung und Entzündung oder in Karzinomen induziert. Um die Rolle der COX-2 im Urothelkarzinom zu untersuchen, wurde ein transgenes Mausmodell verwendet, bei dem die COX-2 cDNA unter dem Keratin 5-Promotor steht, so dass es zu einer konstitutiven Expression von COX-2 im basalen Epithel (u. a. Harnblasenschleimhaut) kommt, welches auf RNA- und Proteinebene sowie mittels Immunfluoreszenz gezeigt werden konnte. Die spontane Entwicklung des entzündlichen, hyperplastischen/dysplastischen Phänotyps im Transgen konnte durch Hemmung der COX-2 Aktivität mittels COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib reduziert wurde. Die spontane Entwicklung des Urothelkarzinoms im Transgen erfolgte scheinbar entlang dem humanen Urothelkarzinom, aufgrund erhöhter Her-2 Level und Ras Aktivierung. Der COX-2 bedingte Phänotyp im Transgen wurde über die EP-Rezeptor Isoformen EP2 und EP4 vermittelt, da deren Expression erhöht war und die beiden EP-Rezeptor Isoformen von Entzündungszellen und von Karzinomzellen exprimiert wurden. Mittels etablierter 2D-DIGE-Technologie konnte im Transgen die differentielle Expression verschiedener Proteinen, wie z. B. Prx-2 oder GST (Phase-II Detoxifizierungs- und antioxidativer Stress Antwortenzyme), detektiert werden, welches einen erhöhten oxidativen Stress implizierte. Durch einen in vitro Ansatz konnte gezeigt werden, dass der erhöhte oxidative Stress im Transgen COX-2 und PGE2 abhängig war. Die Regulation der Transkription der Phase-II und anti-oxidativer Stressgene wird durch den Transkriptionsfaktor Nrf-2 vermittelt, dessen Expression im Transgen erhöht war und seine Zellkerntranslokation COX-2 abhängig erfolgte. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass eine aberrante COX-2 Überexpression den erhöhten oxidativen Stress fördert und die daraus resultierenden Dysregulationen COX-2 bedingter downstream Targets zum hyperplastischen Phänotyp und zur Entwicklung des Urothelkarzinom führen und daher COX-2 eine wichtige Zielstruktur bei der Behandlung des Urothelkarzinoms darstellt.
Proteins are the central molecules of life. To become functionally active, newly synthesized polypeptide chains must fold into unique three-dimensional structures on a biologically relevant time scale. Although the information required for correct folding resides in the linear amino acid sequence of a protein, execution of the folding process under cellular conditions is critically dependent on the assistance of “helper proteins” termed molecular chaperones. This group of proteins shares the common function of binding to newly synthesized non-native proteins to prevent off-pathway reactions which otherwise would lead to misfolding and aggregation. Two major classes of chaperones, the Hsp70s and the chaperonins, have been implicated in de novo protein folding in the cytosol. While Hsp70s are primarily involved in stabilizing nascent chains until a complete domain has emerged from the ribosome and is competent for folding, the barrel-shaped chaperonins provide physically defined compartments inside which complete proteins or protein domains can fold unimpaired by aggregation. Proteins of eukaryotic origin which, on average, have a more complex architecture than their prokaryotic counterparts, often fold inefficiently upon expression in bacterial hosts. For many decades, this phenomenon placed great limitations on the recombinant production of proteins. In the present study, eukaryotic multi-domain proteins were synthesized in cell-free translation systems in order to investigate the contribution of individual chaperones to their de novo folding: Upon expression under chaperone depleted conditions in an Escherichia coli based lysate, the modular eukaryotic protein firefly luciferase was demonstrated to fold by a rapid default pathway, tightly coupled to translation. However, only a minor fraction of the translated protein chains folded correctly. In contrast, supplementation of the lysate with purified trigger factor and DnaK/DnaJ/GrpE increased the amount of native protein, but markedly delayed firefly luciferase folding relative to translation. Interestingly, while the bacterial multi-domain protein ß-galactosidase uses the endogenous chaperone machinery effectively (Agashe et al., 2004), the efficient co-translational domain folding of firefly luciferase observed in eukaryotes is not compatible with the prokaryotic chaperone system. Thus, important differences between bacterial and eukaryotic cells seem to exist in the coupling of translation and folding. Moreover, the bacterial lysate which did not contain any eukaryotic chaperones was further utilized to determine the minimum requirements for the folding of newly synthesized actin. By conducting in vitro translation reactions in the presence of purified components, the chaperonin TRiC was found to be the only eukaryotic chaperone absolutely necessary and sufficient for de novo actin folding. The actin thus produced bound DNase I and polymerized into filaments, hallmarks of its native state. Lysate supplementation with the bacterial chaperonin GroEL/GroES or the DnaK/DnaJ/GrpE chaperones led to mostly soluble actin, yet failed to facilitate its correct folding. Notably, actin folding in the TRiC-supplemented bacterial lysate occurred with slower kinetics when compared to the eukaryotic cytosol. Additionally, TRiC was demonstrated to be capable of mediating the domain-wise folding of modular proteins by their partial encapsulation in the chaperonin cavity. This was based on the fact that upon expression of actin multi-domain fusion proteins both in vivo and in vitro, the proteins properly integrated into yeast cytoskeleton structures as well as formed stable complexes with DNase I. The mechanism of how TRiC might promote the folding of individual protein domains is thereby reminiscent of the domain-wise endoproteolytical degradation of proteins by the proteasome, as reported recently (Liu et al., 2003).
Exosomen sind Vesikel endosomalen Ursprungs, die durch die Fusion von Multivesicular Bodies mit der Plasmamembran von Tumorzellen und anderen Zelltypen in den Extrazellulärraum ausgeschüttet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob auch der Tumormarker CD24 sekretiert wird. Es zeigte sich, dass CD24 sowohl in konditionierten Zellkulturüberständen als auch in malignem Aszites von Patientinnen mit Ovarialkarzinomen in Exosomen vorkommt. In vielen Tumoren korreliert die Expression von CD24 mit einer schlechten Prognose für die Patienten. Während die meisten Tumoren CD24 an der Zelloberfläche exprimieren, weisen Tumoren mit einer CD24-Akkumulation im Zytoplasma eine erhöhte Invasivität auf. Daher sollte überprüft werden, ob ein Zusammenhang zwischen der intrazellulären Lokalisation von CD24 und seiner Nachweisbarkeit in Tumorexosomen besteht. Aus der biochemischen Analyse von Exosomen aus malignem Aszites und deren Vergleich mit immunhistochemischen Färbungen der zugehörigen Ovarialkarzinome wurde jedoch deutlich, dass dies nicht der Fall ist. Um zu zeigen, dass die Aszitesexosomen ihren Ursprung in Tumorzellen haben, wurde der Tumormarker EpCAM in den Aszitesexosomen identifiziert. Hinweise auf die Beteiligung von Exosomen bei der Zellinvasion wurden durch die Detektion der Matrix-Metalloproteinasen MMP-2 und MMP-9 bekräftigt. In Anbetracht der Rolle von Exosomen während der Tumorprogression und bei der Regulation von Immunzellen könnten CD24 und EpCAM als wichtige Markerproteine für die Identifizierung von Tumorexosomen dienen. CD24 stimuliert die Adhäsion, Migration und Invasion von Tumorzellen auf verschiedenen Substraten. Die Daten des zweiten Teils dieser Arbeit zeigen, dass die stabile Transfektion der Karzinomzelllinien A125 und MDA-MB-435S mit CD24 auch die Migration auf Kollagen-1 erhöht. Während über den Mechanismus, durch den CD24 dies verursacht, bislang nur wenig bekannt ist, konnten CD24 hier genregulatorische Eigenschaften nachgewiesen werden. In A125-Zellen stimulierte es die Expression der Matrix-Metalloproteinasen MMP-2, MMP-9 und MMP-13 sowie des Zelladhäsionsmoleküls L1-CAM, deren promigratorische Funktionen während der Tumorprogression bekannt sind. Des Weiteren führte die Antikörper-vermittelte Hemmung von β1-Integrin zum Rückgang der erhöhten Migration CD24-positiver Zellen. Eine frühere Studie unserer Gruppe beschreibt eine regulatorische Wirkung von CD24 auf die Aktivität des Chemokinrezeptors CXCR4 durch die Beeinflussung seiner Lipid Raft-Assoziation. In der vorliegenden Arbeit wiesen CD24-Transfektanten eine vermehrte Lokalisation von β1-Integrin in Lipid Rafts auf. Neben der Wechselwirkung von CD24 mit Proteinkinasen der Src-Familie stellt die Beeinflussung der Lipid Raft-Assoziation einen weiteren Mechanismus dar, wie CD24 die Funktion anderer Proteine beeinflussen kann.
Aberrant hepatic fat accumulation (“fatty liver”) represents a pathophysiological hallmark of obesity and is associated with extended glucocorticoid therapy, obesity, Type II diabetes, and starvation. Elevated glucocorticoid levels under these conditions are causative for the fatty liver phenotype, although the molecular mechanisms of their action remain largely unclear. This study demonstrates that glucocorticoids (GCs) promote fatty liver development through facilitated fat transport into the liver and not due to increased de novo fat synthesis. Transient knock-down of hepatic GR was associated with decreased hepatic gene expression of the fat transporters CD36 and caveolin 1 and with decreased expression of peroxisome proliferation-activating receptor gamma (PPARgamma) – a transcription factor promoting CD36 and caveolin expression. Moreover, glucocorticoids inhibited hepatic expression of transcriptional repressor Hairy and Enhancer of Split-1 (Hes-1) a previously identified anti-lipogenic factor. In fatty liver mouse models characterized by elevated GC levels diminished Hes-1 levels correlated with increased hepatic lipid stores. Genetic restoration of hepatic Hes-1 levels in obese mice normalized hepatic triglyceride levels and improved systemic insulin sensitivity. In mice injected with GCs for three weeks, genetically restored hepatic Hes-1 levels inhibited GC-induced liver fat accumulation. In both models, sustained Hes-1 was accompanied by increased oxidative consumption of triglycerides and decreased fat import into the liver. Hes-1 re-expression inhibited hepatic PPARgamma, CD36 and caveolin expression resembling effects in mice with transient GR knockdown. Loss of function analysis in primary hepatocytes confirmed PPARgamma and Cav1 as Hes-1 target genes. The data suggest that Hes-1 antagonizes GR-mediated transcriptional regulation of fat transport programs in the liver. Mechanistically, glucocorticoid exposure of hepatocytes lead to the disassembly of a cAMP-dependent CREB transactivator complex on the proximal Hes-1 gene promoter. The glucocorticoid receptor was shown here to decrease intracellular P-CREB levels and to interact with CREB via the bZIP domain of CREB. Furthermore, GR associated to glucocorticoid response elements in the proximal Hes-1 promoter region. Inhibition of hepatic Hes-1 provides a rationale for glucocorticoid-induced fatty liver development. Restoration of Hes-1 activity might, therefore, represent a new approach in the treatment of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease and its associated complications such as hepatic insulin resistance.
mRNA localization is a common mechanism for targeting proteins to specific locations within a cell, and is crucial for establishment of cellular asymmetries. In Drosophila, the two main body axis are determined by the localization of three maternal transcripts in the oocyte, bicoid, gurken, and oskar mRNA. oskar mRNA localizes to the posterior pole of the oocyte where it is translated locally, which is crucial for abdomen formation and germline development. Many of the factors regulating this process have been identified by means of genetics, and the majority of them colocalize with the oskar transcript at the posterior pole. However, the precise mechanism of oskar mRNA localization is still not understood. To gain further insight into the process of oskar regulation, I aimed at identifying novel components involved in this process. I participated in a protein-trap screen where GFP fusions were randomly generated, and colocalization with oskar mRNA at the posterior pole of the oocyte was scored. Several lines displaying an enriched GFP signal at the posterior pole were identified. I characterized an independently generated line, in which the gene identified encodes a novel RNA recognition motif (RRM)-containing protein that I named Lupli. By immunostaining, I showed that endogenous Lupli protein displays the same distribution pattern in the oocyte as GFP::Lupli. Lupli associates with the 3’ UTR of oskar mRNA and is a component of the oskar ribonucleoprotein (RNP) complex in vivo. I showed that the late short-range transport of oskar mRNA to the cortex is defective in lupli mutant oocytes at stage 9, and that the microtubule cytoskeleton is not properly polarized. Furthermore, Oskar protein levels are reduced in lupli mutant ovaries. My work thus led to the identification of Lupli as a new component of the oskar RNP complex, and suggests that its function is required for proper localization and expression of oskar in Drosophila oocytes.
Die circadianen Uhren eukaryontischer Organismen bestehen aus einem Netzwerk miteinander verknüpfter Rückkopplungsschleifen. Ein grundlegendes Prinzip darin ist eine negative Transkriptions-Translations-Rückkopplungsschleife, in der ein Protein die Transkription seiner eigenen mRNA zeitverzögert reprimiert. Daher spielt die Regulation der nukleocytoplasmatischen Verteilung einzelner Proteine im molekularen Mechanismus der Uhren eine wichtige Rolle. FREQUENCY (FRQ) ist eine der zentralen Komponenten der circadianen Uhr von Neurospora crassa. Es hemmt zum einen im Zellkern die Transkription seiner eigenen mRNA (negative Rückkopplung), zum anderen fördert es im Cytosol die Bildung des White Collar Komplexes (WCC) bestehend aus den Transkriptionsfaktoren White Collar (WC) 1 und 2 (positive Rückkopplung), der wiederum die Transkription von frequency-mRNA bewirkt. Die zeitliche Abfolge beider Funktionen ist exakt festgelegt, daher muss die subzelluläre Verteilung von FRQ präzise reguliert werden. Um das korrekte Funktionieren der Uhr zu gewährleisten, ist FRQ zum größten Teil im Cytosol und nur zum kleineren Teil im Zellkern lokalisiert, obwohl es ein funktionales Kernlokalisationssignal (NLS) besitzt. frq9 exprimiert durch Leserasterverschiebung ein um ca. 30% C-terminal verkürztes Protein (FRQ9), das überwiegend im Zellkern vorkommt. Der C-Terminus ist also für die unerwartete cytoplasmatische Lokalisation von FRQ verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, welche Teile des C-Terminus die FRQ-Lokalisation beeinflussen und wie die subzelluläre Verteilung bewirkt wird. Die Verteilung kann nicht einer eng umgrenzten Region (z. B. einem putativen Kernexportsignal, NES) im C-Terminus zugeschrieben werden und spiegelt sehr wahrscheinlich ein dynamisches Gleichgewicht aus Kernimport und -export wider. Ein Teil der FRQ-Population könnte durch Modifikation im Zellkern diesem shuttling-Prozess entzogen werden, so dass er nicht wieder in den Zellkern gelangen kann (z. B. durch Maskierung eines Kernlokalisationssignals, NLS). Phosphorylierungen sind ein wichtiger Regulationsmechanismus für FRQ-Funktionen und könnten auch an der Festlegung der subzellulären Lokalisation beteiligt sein. Um in vivo-Phosphorylierungsstellen und Bindungspartner von FRQ massenspektrometrisch identifizieren zu können, wurden verschiedene Affinitätschromatographiemethoden auf ihre Verwendbarkeit in N. crassa getestet. Eine einzelne Methode führte in keinem Fall zu ausreichender Anreicherung von FRQ, aber eine Doppelstrategie aus His6/Ni2+- und StrepTag II/StrepTactin-Aufreinigung erscheint viel versprechend, da beide das Protein aus Totalextrakten depletieren können und die Puffer miteinander kompatibel sind. Schließlich wird ein Satz neuer Expressionsvektoren für die Transformation von N. crassa vorgestellt. Jeder dieser Vektoren komplementiert die Histidinauxotrophie der his-3-Mutante und besitzt einen N. crassa-Promotor, einen Polylinker sowie einen Transkriptionsterminator mit Polyadenylierungsstelle.
Der Stoffaustausch zwischen den Organellen eukaryotischer Zellen basiert auf dem geordneten Transport von Vesikeln. Diese entstehen durch Abschnürung der Membran des Donor-Kompartiments, nachdem die zu transportierende Fracht spezifisch angereichert worden ist. Die Vesikel fusionieren nach Erreichen des Ziel-Kompartiments mit dessen Membran und geben ihren Inhalt an das Innere des Kompartiments ab. Ein Großteil der Proteine, die eine Rolle beim vesikulären Trafficking spielen sind periphere Membranproteine, die aus dem Cytosol rekrutiert werden. Diese Proteine benötigen Membranrezeptoren, spezifische Lipide oder Lipidanker, um an die Membran zu binden. In meiner Doktorarbeit habe ich Lipidmodifikationen, die die physikalischen und funktionalen Eigenschaften von Proteinen beeinflussen, näher untersucht. Palmitoylierung ist eine Lipidmodifikation, die die Membranassoziierung von Proteinen erleichtert. Es handelt sich dabei um eine reversible Anbindung eines Palmitatrestes durch eine Thioesterbindung an die Thiolgruppe eines Cysteins im Zielprotein. Neben seiner Funktion als Membrananker beeinflusst der Palmitatrest die Funktion des angebundenen Proteins. Als Modellsystem wählte ich die Vakuole der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, die in ihrer Funktion den Lysosomen höherer Eukaryoten entspricht. Das vakuoläre Hefeprotein Vac8 ist palmitoyliert und wird in der Zelle für die Vakuolenfusion, die Kontrolle der Vakuolenmorphologie und die Weitergabe von Vakuolen an die Tochterzelle bei der Zellteilung, im folgenden Vererbung genannt, benötigt. In meinen Studien habe ich zwei wichtige Aspekte der Vac8-Palmitoylierung im Besonderen untersucht: (i) wie beeinflusst die Palmitoylierung die Funktion von Vac8 und (ii) auf welche Weise wird die Palmitoylierung von Vac8 reguliert? 1.Der Einfluß der Palmitoylierung auf die Funktion von Vac8. Vac8 beinhaltet eine N-terminale Src homology (SH) 4 Domäne, in der sich die Aminosäurereste befinden, die myristoyliert und palmitoyliert werden. In den meisten Fällen werden Proteine jeweils einmal myristoyliert und palmitoyliert, um stabil in der Membran verankert zu werden. Vac8 besitzt demgegenüber drei potentielle Palmitoylierungsstellen (Cysteine 4, 5 und 7) und es stellte sich die Frage, ob die drei Cysteine individuelle Funktionen erfüllen. Um diese Frage zu beantworten wurden Mutanten generiert, in denen entweder einzelne oder mehrere Cysteine durch Alanin ersetzt wurden. Dabei stellte sich heraus, das Mutanten mit nur einem Cystein, respektive einer Palmitoylierungsstelle, einen stark veränderten Phänotyp hinsichtlich der Proteinlokalisation und –funktion aufweisen, wobei die Position des Cysteins entscheidend für eine effiziente Palmitoylierung ist. Zur Untersuchung der Bedeutung der Palmitoylierung für die Funktion von Vac8 wurde das Protein mit der Src SH4 Domäne versehen, die myristoyliert wird aber statt der Palmitoylierungsstelle einen Abschnitt mit mehreren basischen Aminosäuren enthält. Diese Chimäre lokalisierte zwar wie erwartet auf der Vakuolenmembran, konnte aber eine Vac8 Deletion nicht funktionell komplementieren. Nur durch die Addition eines einzelnen Cysteins in der Src SH4 Domäne konnte die Wildtyp Funktion wiederhergestellt werden. Aufgrund der gewonnen Daten lässt sich daher sagen, dass die Palmitoylierung die Funktion von Vac8 entscheidend beeinflusst. 2.Der Effekt des DHHC Proteins Pfa3 auf die Palmitoylierung von Vac8. In vorhergehenden Studien wurde gezeigt, dass das SNARE-Protein Ykt6 die Palmitoylierung von Vac8 in einer nicht-enzymatischen Reaktion vermitteln kann. Demgegenüber ist die enzymatische Acylierungsreaktion von Vac8 bislang noch weitgehend unverstanden. Das vakuoläre Protein Pfa3 gehört zur Familie der DHHC Transmembranproteine, deren Mitglieder Proteinacyltransferase-Aktivität aufweisen. Daher wurde es als ein Zielprotein gewählt, dessen Einfluss auf die Palmitoylierung von Vac8 näher untersucht wurde. Tatsächlich konnte ich in meinen Studien nachweisen, dass Pfa3 spezifisch zur Palmitoylierung von Vac8 beiträgt. Eine Palmitoylierung anderer vakuolärer Proteine durch Pfa3 konnte demgegenüber nicht nachgewiesen werden. Pfa3 wird nicht für die Vererbung der Vakuole benötigt, muss aber für eine effiziente Vakuolenfusion vorhanden sein. Neben seiner Funktion als Proteinacyltransferase fungiert es als Vakuolen-Sortierungsfaktor für Vac8 und Proteine mit einer Src SH4 Domäne. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das DHHC Protein Pfa3 die Palmitoylierung und die Funktion des Vac8 Proteins beeinflusst.
Maternal proteins and mRNA contribute to both oocyte and embryo development. I performed a genetic screen to identify genes with maternal function in Drosophila. From this screen, I isolated PB4170, which affects CG14998 (ensconsin). The human homologue of this protein, E-MAP-115/Ensconsin, is known to be a microtubule binding protein that interacts dynamically with microtubules. However, its molecular function is poorly understood. From ensconsin mutant analysis in Drosophila, I have found that this gene is specifically required for microtubule-dependent polarity in the oocyte. My results suggest that Ensconsin does not directly affect the stability or orientation of microtubules, but acts through Kinesin, a plus end directed motor that moves cargos along microtubules. I could also demonstrate that Ensconsin is a target of the Par-1 kinase, which has been shown to be required for the establishment of oocyte polarity in Drosophila. In mammals, the Par-1 homolog MARK destabilises microtubules through phosphorylation of microtubule associated proteins (MAPs).In Drosophila, Par-1 directly affects microtubule stability via unkown MAPs, as the MAPs identified so far do not show any polarity defects in the oocyte. As ensconsin mutants do show an oocyte polarity phenotype, this strongly suggests that in Drosophila Par-1 kinase controls oocyte polarity also through the regulation of Kinesin-based transport by phosphorylation of Ensconsin.
Enteroviruses, such as polio- and coxsackievirus, are positive-stranded RNA viruses, and belong to the family of Picornaviruses. Positive-stranded RNA viruses follow a common mechanism to replicate their RNA genomes. First, the viral genome is transcribed into a minus-strand intermediate, which then acts as a template for the synthesis of new plus-strands. The same viral RNA-dependent RNA polymerase synthesizes both RNA strands using viral and host factors to initiate synthesis. Enteroviruses make very efficient use of their small genomes. Several cis-acting replication elements can be found throughout their genome, including one within the coding region. Most of these elements consist of RNA regions, which fold into secondary structures that can form complexes with viral and cellular proteins. Such complex formations are often required to initiate a new step in replication, and thus, function as key players in regulation of the viral life cycle. Some of the cis-acting replication elements have overlapping functions and play a role in several steps in RNA synthesis. In this thesis, two cis-acting replication elements in enteroviruses were analyzed for their roles in RNA synthesis: the cloverleaf structure in poliovirus and the cre(2C) hairpin RNA in coxsackievirus B3 (CVB3). A cloverleaf-like RNA structure formed at the 5’-end of the poliovirus plus-strand is required for negative-strand RNA synthesis but has also been implicated in positive-strand RNA synthesis. Analyzing the precise role of the cloverleaf RNA element in positive-strand RNA synthesis has been hindered by its role in negative-strand synthesis, as mutations disrupting the structure and/or functions on the cloverleaf disrupt minus-strand RNA synthesis. To overcome this limitation, we have developed a novel approach to analyze cis-acting elements with multiple roles in virus replication. Poliovirus replicons were engineered to contain two tandem cloverleaf structures to separate multiple functions. Thus, a downstream cloverleaf, which only supports minus-strand RNA synthesis, allowed the genetic analysis of a 5’-terminal cloverleaf dedicated to promote plus-strand RNA synthesis. Our results reveal that the cloverleaf structure in the plus-strand functions as a promoter for both positive- and negative-strand RNA synthesis. We could show that stem a sequences within the cloverleaf structure are essential for plus-strand RNA synthesis. Also required to initiate plus-strand RNA synthesis are the binding sites for the viral polymerase precursor 3CD and the host factor PCBP2 located within the cloverleaf structure. Furthermore, in a functional assay we could demonstrate that the viral 2C protein is directly involved in plus-strand RNA synthesis. Based on our results, we propose a new model for the initiation of positive-strand RNA synthesis in poliovirus. In the second part of this thesis, the cre(2C) RNA of coxsackievirus B3 and its role in RNA replication was analyzed. A stem-loop element located within the 2C coding region of CVB3 has been proposed to function as a cis-acting replication element. The MFOLD program was used to predict the structure and the precise location of the cre(2C) hairpin. Characterization of the cre(2C) loop showed that a proposed entero- and rhinoviral consensus sequence is also applicable to the CVB3 cre(2C) loop sequence, and that the cre(2C) element functions as a template for VPg-uridylylation in vitro. Even though previous studies of the cre(2C) in poliovirus have shown that the cre RNA is not required for initiation of negative-strand RNA synthesis, we were able to demonstrate that the CVB3 cre(2C) is required for the imitation of both, negative- and positive-strand RNA synthesis.
Die Alzheimer Krankheit („Alzheimer’s Disease“ = AD) ist eine weitverbreitete neurodegenerative Erkrankung des Nervensystems. Von zentraler Bedeutung für die Pathogenese ist eine veränderte proteolytische Freisetzung des Amyloid-beta Peptids (Abeta) aus dem Amyloid-Vorläuferprotein („Amyloid Precursor Protein“ = APP), da die Aggregation von Abeta nach gängiger Meinung eine neuropathologische Kaskade auslöst. APP wird in der Zelle durch verschiedene als Sekretasen bezeichnete Proteasen prozessiert, wobei zwei proteolytische Szenarien möglich sind. Im nicht amyloidogenen Abbau wird APP innerhalb der Abeta-Sequenz von der beta-Sekretase geschnitten, wodurch die Entstehung des pathologischen Abeta Peptids verhindert wird. Die amyloidogene Prozessierung wird initiiert durch die Aktivität einer beta-Sekretase, die APP aminoterminal (N-terminal) von Abeta spaltet. Die Entscheidung, über welchen der beiden Proteolysewege APP abgebaut wird, wird maßgeblich durch Lipide reguliert. In beiden Prozessierungsrouten wird jeweils eine große N-terminale Domäne ins Lumen bzw. extrazellulär freigesetzt, während das resultierende carboxyterminale (C-terminale) Fragment membranverankert bleibt. Diese C-terminalen Fragmente sind Substrate für eine sogenannte beta-Sekretase. Im Falle des amyloidogenen Abbaus wird das 99 Aminosäuren (AS) lange, membrangebundene Fragment (C99) C-terminal von Abeta geschnitten und somit das Peptid aus der Membran freisetzt. Diese zweite Proteolyse ist heterogen und resultiert hauptsächlich in Abeta-Spezies mit einer Länge von entweder 40 oder 42 AS. Die APP Mutationen London und Florida führen zu einem erhöhten Abeta 42/Abeta 40 Verhältnis und verursachen eine besonders schwere Form von AD, da die Entstehung von Abeta 42, das stärker zur Aggregation neigt, der initiierende Schritt in der AD Pathogenese zu sein scheint. Die molekulare und zelluläre Basis des APP Transports, der Prozessierung und der Abeta Produktion sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Komponenten, die mit C99 innerhalb der Lipidmembran interagieren. In einem in vitro System mit an spezifischen Positionen photoaktivierbarem, in Mikrosomenmembranen inseriertem C99, konnte bei UV-Bestrahlung eine Quervernetzung mit Phosphoglycerolipiden beobachtet werden. Dieses Ergebnis wurde in C99-exprimierenden N2a Zellen, die mit photolabilen und radioaktiven Lipidvorstufen markiert wurden, in vivo verifiziert. So interagierten C99 Moleküle mit Lipiden, die aus einem photolabilen Derivat der Stearinsäure aufgebaut waren, nicht aber mit radioaktiven, photoaktivierbaren Derivaten von Phosphatidylcholin (PC), Sphingolipiden oder Cholesterin. Während endogenes APP in Präparationen von Detergens resistenten Membranbereichen (DRMs) zu einem geringen Prozentsatz mit DRMs assoziiert vorliegt, konnte überexprimiertes C99 nicht in DRMs nachgewiesen werden. Die subzelluläre Lokalisation von C99 ist in der Literatur sehr umstritten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Fusionsproteine aus YFP („yellow fluorescent protein“) oder CFP („cyan fluorescent protein“) mit C99 in Vero Zellen im Golgi-Apparat lokalisiert sind. C99 Wildtyp und C99 mit den pathogenen Mutationen London und Florida verhielten sich in Crosslink-Experimenten, der subzellulären Verteilung und in Präparationen von DRMs identisch. In einem Markierungsexperiment von SH-SY5Y-Zellen mit photolabilen Lipidvorläufer-Molekülen wurde von den fünf Komponenten der gamma-Sekretase nur glykosyliertes Nicastrin (Nct) mit [3H]-photo-Cholesterin markiert, während mit nichtglykosyliertem Nct oder den weiteren gamma-Sekretase Untereinheiten keine Interaktion mit Cholesterin detektiert werden konnte. Reifes Nct wurde zusammen mit einem weiteren, noch nicht identifizierten Protein, mit [3H]-photo-Sphingosin markiert. Demgegenüber war die Interaktion von Nct mit [3H]-photo-Phosphatidylcholin war nur sehr schwach und zeigte keine Präferenz für reifes oder unreifes Nct. Demnach scheint mindestens eine Komponente der gamma-Sekretase eine hohe Affinität für Raft-Lipide zu haben, während C99 offensichtlich hauptsächlich außerhalb von DRMs existiert. Geringe Mengen von C99, das mit DRMs assoziiert vorliegt, könnten zur Produktion von Abeta 42 führen, was aber noch genauer untersucht werden muss.
In women, breast cancer is the most common cancer and accounts for most cancer deaths. The molecular mechanisms underlying this pathology are diverse and contribute to the complexity of the disease. Early diagnosis and detailed molecular characterization of tumours significantly increase the prognosis for the patients. A limited number of breast cancer markers are already used for diagnosis, characterization, and determination of the most promising therapy of breast cancer tumours. Although new therapeutic approaches such as herceptin antibodies are now available on the market, new markers that are specific for a subset of breast cancer patients are urgently needed. A major criterion in breast cancer diagnosis is the presence of the estrogen receptor alpha (ERα) which is associated with better prognosis and often sensitivity to anti-estrogen therapy. ERα is a ligand-inducible transcription factor that modulates expression of estrogen responsive target genes involved in both, physiological and pathological conditions such as breast cancer. Despite the complexity of the regulatory mechanisms, a variety of mechanisms resulting in transcriptional activation of target genes have been characterised. Although about 50 % of estrogen-responsive genes are repressed in response to estrogen treatment, the mechanisms underlying this regulation are just beginning to be discovered. This thesis aimed to study expression and regulation of the breast cancer and salivary gland expression gene (BASE). The evaluation of this gene was interesting for two reasons: firstly, its expression is strongly repressed by estrogen suggesting involvement of ERα, and secondly, previous studies indicate that the expression of this putative secreted protein is restricted to breast cancer cells and salivary gland. Therefore, BASE has the potential to function as a new breast cancer marker. One major finding of this study is the strong separation of expression and regulation of BASE. Expression of the gene is depending on the transcription factor FoxA1, which binds in a regulatory region about 2 kb upstream of the transcription start site. Although essential for expression, FoxA1 has no function in BASE regulation. Furthermore, this study shows that the BASE gene is rapidly repressed after estrogen-treatment and that ERα is required for this regulation. ERα can bind the BASE promoter in the same regulatory region as FoxA1, however, direct binding seems not to be a critical prerequisite. Based on the data obtained in this study, two molecular models for the mechanism of repression are proposed. Furthermore, analysis of normal and primary breast tumour samples in collaboration with M. Kerins group in Galway confirmed BASE expression in about 50 % of the samples. Therefore, BASE remains an interesting candidate as breast cancer marker. In a side project investigating the mechanism of estrogen mediated activation of target genes, the CTSD gene has been further characterized. Besides the well characterized proximal promoter, the functionality of two further ERα binding sites, located 9 kb and 33 kb upstream of the transcription start site, have been reported. This study confirmed binding of ERα and PolII to the 9 kb upstream enhancer and moreover, the ability of this site to convey estrogen-stimulation was confirmed. Whether the enhancer requires physical interaction with the proximal promoter to enable transcriptional activation remains to be further examined.
The N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors belong to the family of ionotropic glutamate receptors. They play a critical role in neuronal pattern formation during development and in synaptic plasticity as molecular coincidence detectors. NMDA receptor is a tetrameric protein complex comprised of two obligatory NR1 subunits and two identical or different NR2 subunits, of which four types exist named NR2A-D. In rodents and other mammals, NR1 and NR2B are expressed in the entire central nervous system, already at embryonic stages, whereas NR2A expression starts and increases only postnatally to coexist with NR2B in the adult brain. Mice lacking the NR1 subunit or lacking the NR2B subunit die at birth, whereas mice lacking NR2A are viable. Both NR2A and NR2B containing NMDA receptors are implicated in synaptic plasticity, learning and memory formation but their distinctive functions are unknown. The NR2B subunit received a lot of attention because mice genetically altered to overexpress NR2B showed improved spatial reference memory and enhanced LTP. The lethality of the general NR2B knock-out gives rise to the necessity of a conditional knock-out, by which deleterious effects due to lack of NR2B during embryogenesis are prevented, and the physiological function of NR2B can be elucidated in the postnatal brain. For this purpose, a DNA construct for homologous recombination in embryonic stem (ES) cells was generated with NR2B allele exon 6 flanked by loxP sequences. This exon encodes the region preceding the first transmembrane domain of the NR2B subunit. As a selection marker, a neomycin resistance gene flanked by frt sites was introduced in intron 6. The selection marker was subsequently removed by flp recombinase from the targeted NR2B allele, and the ES cells were used for blastocyst injection to derive NR2B2lox mice. NR2B2lox mice were bred with TgCre4 mice, selectively expressing Cre recombinase in forebrain principal neurons, to generate mice heterozygous for the transgene TgCre4 and homozygous for the conditional NR2B allele (NR2B2lox/2lox). In these mice (NR2B(delta)Fb), postnatal forebrain principal neurons should lack NMDA receptors containing the NR2B subtype. Deletion of NR2B in NR2B(delta)Fb mice was revealed by electrophysiological measurements. In parallel, in this study, also lentiviral mediated gene delivery was used in vivo for Cre/loxP mediated DNA recombination. Recombinant lentivirus encoding Cre recombinase and the GFP protein under the control of the alpha-CaMKII promoter was delivered stereotactically to the hippocampal CA1 region of NR2B2lox/2lox mice at P20. Lack of NR2B was assessed by electrophysiological measurements of synaptic and whole-cell NMDA currents, using NR2B specific antagonists. Recordings from CA1 neurons revealed reduced NMDA currents, lack of sensitivity to ifenprodil, a selective blocker of NR2B containing NMDA receptors, and faster than wild type deactivation kinetics of NMDA mediated currents, indicating the effective loss of the NR2B-type NMDA receptors. Frequency and AMPA component of miniature EPSCs were unaltered whereas the NMDA component was reduced. Moreover an impairment of cellular LTP could be shown. Western blot analysis from hippocampal homogenates of NR2B(delta)Fb mice showed a 70% reduction of the NR2B subunit levels, and no significant change in the expression levels of NR2A, and of the AMPA receptor subunits GluR-A and GluR-B. Collectively, these studies describe a conditional mouse model for elucidating the particular physiological functions of the NR2B type of NMDA receptors in the adult forebrain.
The hormone 17beta-estradiol (E2) and its receptor estrogen receptor alpha (ERalpha) have neuroprotective effects in animal models of stroke in rodents. In contrast, clinical studies revealed, that long term treatment with estrogens lead to an increased risk of dementia and stroke. These controversy shows, that there is a need for a better understanding of E2 and ERalpha action in stroke. To investigate the role of ERalpha in stroke, three cell type specific ERalpha knock out mouse-strains were generated using the Cre-loxP system: a neuronal specific ERalpha knock out mouse strain (CaMKIICre/ERfl/fl), a microglial specific ERalpha knock out mouse strain (LysMCre/ERfl/fl) and an endothelial specific ERalpha knock mouse strain (Tie2CreERT2/ERfl/fl). These mouse-strains were analysed for tissue specific deletion of ERalpha. Deletion of ERalpha in neurons of CaMKIICre/ERfl/fl-mice was complete, in LysMCre/ERfl/fl-mice ERalpha was deleted in 92% of the microglial cells whereas the deletion of ERalpha was incomplete in endothelial cells of the vascular system in the Tie2CreERT2/ERfl/fl-mice. Due to these results the Tie2CreERT2/ERfl/fl mouse-strain was excluded for further experiments. To investigate the role of ERalpha in neurons and in microglial cells in stroke, experiments using a model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) were performed. Analysing the stroke volume after performing a MCAO in CaMKIICre/ERfl/fl-mice and in LysMCre/ERfl/fl-mice revealed, that it is neuronal ERalpha and not microglial ERalpha which mediates the neuroprotective effects of E2 in stroke. Furthermore it was shown, that E2 has neuroprotective effects in female as well as in male mice, and that in both sexes the neuroprotecive effect of E2 is mediated via neuronal ERalpha. For a better understanding of the molecular mechanisms underlying these neuroprotective effects mediated by neuronal ERalpha, the expression of several genes in female CaMKIICre/ERfl/fl-mice was investigated. It was shown in this work, that ERalpha is upregulated in stroke, whereas Bcl-2, Summary 4 cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART), cyclooxygenase 2 (COX-2), prostaglandin E2 EP1 receptor (EP1) and prostaglandin E2 EP2 receptor (EP2) transcription was unchanged. Brain derived neurotrophic factor (BDNF) was upregulated upon E2 treatment in stroke. The upregulation of BDNF was independent from neuronal ERalpha since its transcription was elevated in the neuronal ERalpha knock out mice as well. Taken together, it was demonstrated in this work, that neuronal ERalpha and not microglial ERalpha plays a major role in E2 mediated neuroprotection in stroke.
Anopheles gambiae is the most prominent vector of human malaria in Africa. The causative agents of this disastrous disease are unicellular eukaryotic parasites of the genus Plasmodium which are transmitted to humans by infected female mosquitoes when they take a blood meal. During its development in the mosquito, Plasmodium undergoes massive losses suggesting that mosquitoes are able to mount an immune response that limits parasite infection. However, the molecular mechanisms underlying parasite invasion, immune evasion, its recognition and killing via the vector are not well understood. We have functionally analysed the orthologous SRPN6 genes from Anopheles stephensi and Anopheles gambiae and showed that they are specifically expressed in midgut cells invaded by Plasmodium ookinetes. Phenotypic analysis via RNAi knock down indicates that AsSRPN6 is involved in the parasite killing process, whereas AgSRPN6 acts on parasite clearance, by promoting parasite lysis. Furthermore, SRPN6 is also a parasite induced salivary gland epithelial marker located at the basal side of epithelial cells in proximity to invading sporozoites. Knockdown of SRPN6 had no effect on oocyst rupture but significantly increased the number of sporozoites present in salivary glands. Midgut invasion is vital for the parasite life cycle progression. We show that Δpplp5 ookinetes cannot invade midgut epithelial cells and are retained attached to the midgut, possibly, due to the fact that, these mutant parasites can not form pores in the plasma membrane. Haemocytes secrete immune factors such as opsonins, proteases and their negative regulators as well as antimicrobial peptides, all crucial for immune responses. We report the first genome wide molecular characterisation of Anopheles gambiae circulating haemocytes, presenting a list of 1587 genes we strongly suggest are expressed by these cells.
Phosphoinositide sind wichtige Lipidsignalmoleküle, die an der Regulation vieler intrazellulärer Vorgänge beteiligt sind. Sie werden durch das Zusammenspiel von spezifischen Lipidkinasen und Lipidphosphatasen reguliert, die selbst einer genauen Regulation unterliegen müssen. Die Lipidphosphatase Sac1p in Hefe kann PtdIns(4)P-Signale an Membranen des ER und Golgi-Apparates hydrolysieren. Dabei wird die räumliche Regulation und Koordination der katalytischen Aktivität von Sac1p durch einen Lokalisationswechsel zwischen ER und Golgi-Apparat gewährleistet. Außerdem wurde beobachtet, dass eine Regulation auf transkriptioneller Ebene stattfindet. So waren zelluläre Menge einer sac1- Variante mit reduzierter Phosphataseaktivität im Vergleich zu Wildtyp-Sac1p erhöht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expressionskontrolle von SAC1 durch genetische und funktionelle Analysen untersucht. Mit Hilfe von verkürzten und mutierten Promotorkonstrukten konnte eine Region innerhalb des SAC1-Promotors identifiziert werden, die für die Transkription essentiell ist. So wurde gezeigt, dass die Deletion der Basen –100 bis –92 stromaufwärts des SAC1-Startcodons innerhalb des Gesamtlängepromotors zum Verlust der transkriptionellen Aktivität führt. Die Sequenz dieser essentiellen Region lautet ACCAGAGGT. Die jeweils äußeren drei Basen bilden dabei eine palindromartige Struktur aus. Mit Gelshiftanalysen konnte nachgewiesen werden, dass an die intakte Basensequenz ein bisher unbekannter Proteinfaktor bindet. Werden die jeweils äußeren drei Basenpaare deletiert, wird die Bindung des Proteinfaktors weitestgehend unterbunden. Wurden Oligonukleotide, die die spezifische Sequenz enthielten, an CNBr-Sepahrose gekoppelt, so war man in der Lage, spezifisch bindende Proteine in solchen Mengen aufzureinigen, die massenspektrometrischen Sequenzanalysen genügten. Jedoch konnte der bindende Faktor nicht identifiziert werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass der SAC1-Promotor inositolsensitiv ist. Unter Inositolmangelbedingungen war die Promotoraktivität erhöht, Inositolüberschuss hatte eine Erniedrigung der Aktivität zur Folge. Zusammen mit dem bekannten Phänotpyen der Inositolauxotrophie einer sac1 D-Mutante, stellt dies einen Hinweis dar, dass die Expressionsregulation von SAC1 mit dem Lipidstoffwechsel gekoppelt ist. Die Analyse der SAC1-Expression im Zusammenhang mit der Regulation von Genen der Inositolbiosynthese hat jedoch ergeben, dass Inositol nicht das direkte Signal ist, welches die Promotoraktivität reguliert. Es konnte ebenfalls demonstriert werden, dass die Aktivität des SAC1-Promotors mit der intrazellulären PtdIns(4)P-Menge korreliert. So war der Promotor in sac1 D-Zellen, die durch zehnfach erhöhte PtdIns(4)P-Mengen charakterisiert wurden, deutlich aktiver. Wurden die sac1 D-Zellen mit temperatursensitiven Lipidkinasemutanten kombiniert, so sank die Aktivität des Promtors entsprechend der Reduktion von intrazellulärem PtdIns(4)P. Damit war ein Hinweis gefunden, dass intrazelluläres PtdIns(4)P das Signal sein könnte, das die Promotoraktivität von SAC1 steuert. Möglicherweise wird das Lipidsignal über spezifische lipidbindende Proteine von der Membran in den Nukleus transportiert. Mit Hilfe von biotinylierten, PtdIns(4)P-enthaltenden Lioposomen konnte eine Methode entwickelt werden, die es erlaubt, nach PtdIns(4)P-interagierenden Faktoren zu suchen. Diese Methode kann nicht nur für die Charakterisierung der Bindeeigenschaften lipidbindender Proteine eingesetzt werden, sondern auch für die Aufreinigung von Proteinmengen, die für eine Detektion durch Coomassiefärbung ausreichend sind. Durch weitere Aufskalierungen sollte man in der Lage sein, auch weniger abundante Proteine zu identifizieren, die spezifisch mit PtdIns(4)P interagieren können.
Germline inactivation of the mineralocorticoid receptor (MR) gene in mice results in early postnatal lethality due to massive loss of sodium and water associated with impaired epithelial sodium channel (ENaC) activity in kidney and colon. The aim of the present study was the analysis of the role of renal principal cell MR, which is activated by aldosterone, in ENaC-mediated sodium reabsorption. For this purpose, mice deficient for MR in ENaC-expressing renal principal cells were generated using the Cre-loxP recombination system. A large fragment of genomic mouse DNA harbouring 156 kb of the aquaporin 2 (AQP2) gene was used to drive the expression of Cre recombinase in principal cells (AQP2Cre mice). Mice carrying a conditional MR allele were crossed with AQP2Cre mice to obtain mutant (MRAQP2Cre) mice. MRAQP2Cre mice developped normally under standard diet and exhibited unaltered renal sodium excretion, but strongly elevated plasma aldosterone levels. When challenged with a low-sodium diet, MRAQP2Cre mice showed increased renal sodium and water excretion resulting in a continuous loss of bodyweight. Immunofluorescence for MR and ?ENaC staining revealed that the loss of MR expression is restricted to principal cells of the collecting duct (CD) and late connecting tubule (CNT), and that MR is crucial for apical ?ENaC trafficking to the apical membrane. The early CNT that accounts for about 30% of the CNT was not targeted. Determination of the fractional excretion of sodium before and after treatment with the ENaC blocker amiloride showed that renal ENaC activity in the mutant mice was preserved. These data demonstrate that the late distal convoluted tubule (DCT) and early CNT, which were not targeted in MRAQP2Cre mice, can compensate to a large extent impaired ENaC-mediated sodium reabsorption in the late CNT and CD. To overcome a possible postnatal lethality of the MRAQP2Cre mice, an inducible principal cell-specific gene inactivation system was established in parallel to induce MR inactivation in adult mice. The large genomic DNA fragment harbouring the AQP2 gene, used for the generation of the constitutive AQP2Cre transgene, was also used to drive the expression of the tamoxifen-inducible CreERT2 fusion protein (AQP2CreERT2 mice). Three AQP2CreERT2 transgenic lines containing 1, 4 and 9 copies of the transgene respectively were established and showed tamoxifen-induced recombination in most of the renal principal cells, but leakiness of the fusion protein in the papilla region of the kidney. To identify aldosterone-regulated genes potentially involved in the control of ENaC-mediated renal sodium reabsorption, gene expression profiling using microarrays was performed on a mouse renal cortical CD principal cell line (mpkCCDc14) in the presence or absence of aldosterone. Quantitative RT-PCR for the identified candidates on microdissected CDs from control mice fed with standard or low-sodium diet confirmed the induction by aldosterone of the genes encoding the serum- and glucocorticoid-regulated kinase 1 (Sgk1) and the ubiquitin-specific protease 2 (Usp2). Quantitative RT-PCR on microdissected CDs from control mice and principal cell MR-deficient (MRAQP2Cre) mice under low-sodium diet showed that the gene expression levels of Sgk1 and the serine/threonine protein kinase 3 (Pim3) were reduced in the mutant mice. Thus, these data identified Pim3 as a new MR-regulated gene involved in the control of ENaC-mediated sodium reabsorption.
A?-amyloid peptide (A?), that plays a central role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease is derived by sequential proteolytic processing from the amyloid precursor protein (APP) by ?- and ?-secretase. APP is additionally processed through a non-amyloidogenic pathway by ?-secretase. Recent work suggests that amyloidogenesis is highly dependent on the levels of cholesterol within plasma membrane/early endosomes’ microdomains termed “rafts”. Indeed APP cleaving machinery, required for A? generation has been shown to reside in lipid rafts and the secretase activity on APP to depend on membrane cholesterol levels. Counterintuitive to the localization of cleavage machinery, the substratum protein APP localizes, at constitutive levels of expression, in membrane microdomains enriched in phospholipids (PL), so-called non-raft domains. From these two series of results it arises that not only cholesterol-rich rafts but also cholesterol-poor/PL-rich non-rafts could be important modulators of AD implicated APP processing. In this work, I have addressed the question of how changes in the lipidic content of non-raft domains, where APP concentrates, affect proteolytic processing of this protein. As phosphatidylethanolamine (PE), an important regulator of diverse cell processes, accounts for the majority of PL I focused on the regulation of APP proteolyisis by this particular PL. For this purpose I utilized Drosophila melanogaster and mammalian model systems. Confirming previous work, APP was found in the non-raft domains of either insect or mammalian cells, excluded from cholesterol/ergosterol/Flotilin that enrich in rafts. The activity of ?-secretase on APP that is the crucial step in A? generation was assayed in Drosophila in vivo system using fly strains transgenic for human APP-C-terminal fragment, fused to the GAL4-VP16 (GV) transcription factor. Membrane PE levels in these ??secretase reporter flies were depleted by introducing the easPC80 mutation, that affects ethanolamine kinase (ETNK) an enzyme involved in PE synthesis pathway. A strong downregulation of hAPP-Ct processing by ?-secretase, readout by GV triggered cell lethal GRIM and GFP reporter genes expression was observed in low membrane PE flies compared to the ?-reporter flies with wild-type membrane PE levels. The effect of PE on APP proteolysis was additionally observed in mammalian HEK 293 cells stably expressing hAPP. In these cells membrane PE levels were altered by the treatment with RNAi directed against diverse PE synthesis enzymes including ETNK. Membrane PE level decrease, caused by RNAi treatment was shown to correlate with a downregulated ?- and ?-secretase processing of APP and correspondingly an elevated ?- secretase activity on APP. In the present study I could show that besides cholesterol/raft microdomains, PL (in particular PE), which are the major lipids in APP surrounding non-raft microdomains, appear to be involved in the regulation of APP proteolysis. From all the above I conclude that APP cleavage efficiency is highly dependent on the levels of the lipidic environment of non-raft domains, either because of affecting the degree of accessibility of the responsible cleaving enzymes to APP or by affecting the capacity of these enzymes to cleave the substratum. These are in my view important venues for future investigation, opened by this work.