Studien haben gezeigt, dass der Malaria-Erreger einen starken Selektionsdruck auf den menschlichen Wirt ausübt. Genetische Faktoren des menschlichen Wirts spielen eine wichtige Rolle im Verlauf der Malaria-Erkrankung. Der Malaria-Erreger infiziert und vermehrt sich in den roten Blutkörperchen des Menschen. Genetische Polymorphismen, die für ihre schützende Wirkung vor Malaria bekannt sind, kommen daher vor allem in den roten Blutkörperchen vor. Die Pyridoxal kinase (PdxK) der Erythrozyten spielt eine wichtige Rolle in dem Metabolismus von Vitamin B6. In 1976 wurde bereits versucht den Zusammenhang zwischen der niedrigeren Aktivität der erythrozytären PdxK und einer verminderten Anfälligkeit für Malaria herzustellen. Mittlerweile ist der genetische Hintergrund für die niedrigere Aktivität der PdxK in Erythrozyten bekannt. Es konnte gezeigt werden, dass eine 8 bp Insertion im Promoter des pdxk Gens zu einer höheren Aktivität des Enzyms in den roten Blutkörperchen führt. Bei Abwesenheit dieser 8 bp Insertion hingegen ist die Aktivität von PdxK verringert. In meiner Doktorarbeit untersuchte ich, ob die niedrige PdxK Aktivität einen Einfluss auf dem Malaria-Erreger, Plasmodium falciparum, in vitro hat. Meine Daten haben gezeigt, dass Individuen ohne die 8 bp Insertion im Promoter des pdxk Gens, in ihren Erythrozyten eine geringere Menge des Proteins vorhanden ist und dadurch auch eine niedrigere Aktivität des Enzyms aufweisen. Ich habe darüber hinaus beobachtet, dass das Wachstum des Parasiten gehemmt ist, wenn er in Erythrozyten von Individuen mit einer niedrigen PdxK Aktivität kultiviert wird. Der Parasit reagiert auf dieses genetische Merkmal mit einer Hochregulierung der eigenen Enzyme für die Erhaltung des Vitamin B6 Haushalts. Meine Daten haben auch gezeigt, dass die Abwesenheit des 8 bp Insertion in dem pdxk Promoter, die zu einer niedrigeren PdxK Aktivität führt, häufiger bei Afrikaner als bei Europäer auftritt. Meine Ergebnisse weisen darauf hin, dass die niedrigere PdxK-Aktivität in Erythrozyten ein genetisches Merkmal ist, das wahrscheinlich gegen Malaria schützen kann.
HIV-1 ist in den letzten drei Jahrzehnten im Fokus intensiver Forschung gewesen. Trotzdem sind die frühen Schritte des Zelleintritts noch nicht im Detail verstanden. Die Fusion und die direkt nachfolgenden Schritte der Virusinfektion sind mit den herkömmlichen biochemischen und virologischen Ensemblemessungen nur auf Kosten der Zeitauflösung und durch die Verwendung artifizieller Synchronisationsmethoden zu adressieren. In dieser Arbeit wird die virale Fusion mittels live cell imaging auf Einzelpartikelebene untersucht. Dazu war die Etablierung eines auf Fluoreszenzsignalen beruhenden Indikators für Fusion nötig. Um dies zu erreichen wurden bereits vor dieser Arbeit an inneren Partikelstrukturen fluoreszenzmarkierte HIV-Partikel mit einer zusätzlichen Fluoreszenzmarkierung in der Virusmembran versehen. Die Membranmarkierung sollte im Moment der Membranfusion an der zellulären Membran verbleiben und sich so von der ersten Fluoreszenzmarkierung trennen. Als effektive membranmarkierungsmethode stellte sich die Pseudotypisierung der HIV-Partikel mit MLV.Env.YFP heraus. Gegenüber dem HIV-Hüllprotein besitzt das MLV-Hüllprotein eine hohe Fusogenität, was für die Detektion von Fusionen einzelner Partikel ein Vorteil ist. Um die Detektionswahrscheinlichkeit einzelner Fusionsereignisse weiter zu erhöhen, wurde ein neuer Versuchsaufbau in der Abteilung etabliert. Das gewählte Verfahren erlaubte die einfache Quantifizierung der Virus-Zell-Interaktionen. Nach ausführlicher Charakterisierung wurden mittels eines automatisierten Virustracking-Algorithmus mehr als 20.000 einzelne Partikel verfolgt und 28 Fusionen auf Einzelpartikelebene als Farbtrennungsereignisse detektiert. Um die frühen Ereignisse der Infektion besser zu verstehen, wurden die inneren Partikelstrukturen über unterschiedliche fluoreszenzmarkierte HIV-Proteine visualisiert. Das Verhalten der fluoreszenzmarkierten Proteine nach der Fusion wurde miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass Viren mit dem MLV-Hüllprotein effizient an der Plasmamembran fusionierten. Außerdem blieb das fluoreszenzmarkierte Matrix-Protein, von dem bislang angenommen wurde, dass es sich nach der Fusion schnell im Zytosol auflöst, über längere Zeit als punktierte Struktur sichtbar. In unserem experimentellen System kann die Trennung der Matrix vom Viruskern auch erst Minuten nach der Fusion erfolgen.
The global burden of Malaria remains high with a 2.2 billion people estimated to live in endemic areas (Snow et al, 2005). Prompt and efficacious chemotherapy remains an important cornerstone in the fight against malaria. Development of resistance is the parasite’s mechanisms to respond to massive drug pressure. In this study I analysed drug-parasites interactions in vivo and in vitro using discreet experimental approaches. I started by studying parasite survival in vivo, 7 days after treatment intervention. In the following, I analysed parasites isolates in vitro that had been exposed to various drugs over the last years in the community. In the final part of the project, I attempted to gain insight in the evolution of drug resistance in vitro. For this work, I set up induction of resistance experiments in vitro and analysed in a time course mechanisms of resistance. Of particular interest was here the relationship between gene amplification and the emergence of single nucleotide polymorphisms. The results presented in this work show that 7 days after start of treatment (artemisinin combination therapy or amodiaquine) subpatent parasite populations were detected in 64/156 patients (41%) with high sensitivity. However, persistence of parasites was not associated with recrudescent infection at the individual level but showed instead correlation with initial parasite density in potentially less immune patients. Analysis of field isolates revealed high prevalence of anti-folate resistance due to triple and double mutant Pfdhfr. In theses parasites, no gene copy number variations were detected for genes involved in the folate pathway. However, induction of pyrimethamine resistance in vitro, lead to Pfdhfr amplification in two laboratory strains 3D7 (31 fold) and FCR3 (9 fold) associated with high cross-resistance to cycloguanil and trimethoprim but not to chloroquine. Further, I was able to identify gene amplification as a mechanism for acquisition of S108N in Pfdhfr. My findings of persistent subpatent parasitaemia after treatment underline the need of understanding clearance rate, persistence and elimination of parasites after anti- malarial treatment, particularly in regard to recent reports of emerging artemisinin resistance in western Cambodia (Dondorp et al, 2009), My results also suggest that resistant phenotypes may persist in parasite populations, once introduced. And finally, my data suggest gene amplification as an intermediate step in the acquisition of resistance conferring point mutations in P. falciparum.