Die frühen Schritte einer Infektion, d.h. Anheftung der Viren an und Aufnahme in die Zelle, sind entscheidend für die hohe Wirts- und Gewebsspezifität der Hepatitis B Viren und somit den Erfolg der Infektion. Diese sind aber bisher auf molekularer Ebene nur unzureichend verstanden. Eine Ursache hierfür ist die ineffiziente Infektion primärer Hepatozyten, die im Gegensatz zu der äußerst effizienten Infektion in vivo steht. Um sich Einblicke in die Unterschiede der beiden Systeme zu verschaffen, wurde in dieser Arbeit am Tiermodell des Enten Hepatitis B Virus (DHBV) erstmals quantitativ die in vivo Infektion der Pekingente mit der in vitro Infektion primärer Entenhepatozyten verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anheftung der Viren in der Leber in vivo im Gegensatz zu in vitro schnell und äußerst effizient erfolgt. Dieser Unterschied könnte auf dem aktiven Transport der Viren durch den Blutstrom in die Leber und auf der höheren Konzentration der Viren in der Leber beruhen. Ein weiterer Unterschied der beiden Systeme zeigte sich vermutlich bedingt durch den Zustand der Zellen im Verlauf der produktiven Primärinfektion, die in vivo bereits nach einem, in vitro erst nach drei Tagen detektierbar war. Nach der Aufnahme der Viren in die Zellen wurde in beiden Infektionssystemen aufgrund eines intrinsischen Abwehrmechanismus ein großer Teil der Viren abgebaut. Von den persistierenden Viren führte mindestens jedes zehnte zu einer Infektion, was zeigt, dass die Viruspartikel im Gegensatz zu vielen anderen Viren hoch infektiös sind. Die Ausbreitung der Infektion erfolgte in beiden Systemen synchron und bevorzugt auf die umliegenden Zellen. Dies lässt sich durch die lokal erhöhte Konzentration der Nachkommenviren erklären, zusätzlich in vivo begünstigt durch die dreidimensionale Struktur der Leber. Die Suche nach weiteren stimulierenden Faktoren führte zu der Beobachtung, dass Hepatozyten in der Umgebung von Zellen, die das virale Hüllprotein exprimierten, vermehrt infiziert wurden. Um den Eintrittsmechanismus der Viren in die Zelle aufzuklären, wurde im zweiten Teil der Arbeit eine detaillierte in vitro Analyse der Zellassoziation der Viren und der nachfolgenden Schritte durchgeführt. Folgende Erkenntnisse konnten erlangt werden: Die Bindung und Infektion von DHBV ist konzentrations- und zeitabhängig und wird nicht durch eine Sättigung des primären Rezeptors limitiert. Überexpression des zellulären Interaktionspartners Carboxypeptidase D in Hepatozyten zeigte, dass dieser Faktor die Primärbindung der Viren an die Zellen nicht limitiert. Die Inokulation von Viren bei tiefen Temperaturen führte zu einer drastischen Reduktion der Infektion, während die Zellassoziation weitgehend unbeeinflusst blieb. Dies zeigt, dass die im Fall von DHBV beobachtete Bindung der Viren bei tiefen Temperaturen, wie sie bei vielen anderen Viren durchgeführt wird, um die Zellassoziation und Infektion zu synchronisieren, nicht die produktive Bindung reflektiert. Mit Hilfe replikationsdefizienter rekombinanter Viren wurden die Schritte der produktiv werdenden Viruspartikel verfolgt, woraus ein mehrstufiges Modell abgeleitet werden konnte. Eingangs erfolgt eine reversible Bindung der Viren an die Zelloberfläche, die sensitiv gegenüber neutralisierenden Antikörpern ist. Die anschließende energieabhängige, irreversible Bindung ist Antikörper-resistent, jedoch noch Säure-sensitiv und erfolgt nicht bei niedriger Temperatur. Die Internalisierung der Viren zu einem dritten, Säure-resistenten, Zustand vollzieht sich sehr langsam. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die wesentlichen Unterschiede der DHBV-Infektion in vivo und in vitro nur vor, aber nicht nach der Zellassoziation liegen. Die Infektion begleitende Degradation von Viruspartikeln in Leberzellen stellt eine wesentliche Determinante der Infektionseffizienz von Hepadnaviren dar, die in vivo und in vitro in gleichem Maße erfolgt. Diese Verteidigungsstrategie des Organismus wird jedoch durch die effiziente Ausbreitung der Infektion erfolgreich umgangen.
Kaliumkanäle, die wie andere Ionenkanäle und Membrantransportproteine ein wichtiges Bindeglied zwischen dem extrazellulären bzw. luminalen Raum und dem Zellinneren darstellen, spielen eine Rolle in diversen zellulären Prozessen wie Aufrechterhaltung des Membranpotentials, Frequenz und Verlauf von Aktionspotentialen, Sekretion und Signaltransduktion. Sie bilden temporär Poren in der Membran, durch die hochselektiv Kaliumionen entlang eines elektrochemischen Gradienten transportiert werden können. Ihre Einbindung in zahlreiche physiologische Prozesse impliziert ihre strikte Regulation auf mehreren Ebenen, angefangen bei der Gewebe-spezifischen Expression über die Kontrolle der Kopienzahl am Ort ihrer Aktivität, bis hin zu den Regulationsmechanismen der Öffnungswahrscheinlichkeit der Pore und der Ionenselektivität. Ein funktioneller Kaliumkanal wird durch die Zusammenlagerung von homomeren oder heteromeren Untereinheiten gebildet, wobei bis zu vier primäre oder !-Untereinheiten den Kanal bilden und mit weiteren akzessorischen bzw. "-Untereinheiten assemblieren können. Für die Funktionalität von pankreatischen ATP-sensitiven Kaliumkanälen ist eine stöchiometrisch korrekte Assemblierung der beiden Untereinheiten Kir6.2 und SUR1 essentiell. Vier Kanal-bildende Untereinheiten Kir6.2 müssen sich mit vier regulatorischen SUR1-Untereinheiten zu einem Oktamer zusammenlagern, damit der am Prozess der Insulinsekretion beteiligte Kaliumkanal zur Plasmamembran transportiert werden kann. Die Regulation auf der Ebene der Assemblierung erfolgt durch die Anwesenheit von ER-Lokalisationssignalen in den zytosolischen Domänen beider Proteinuntereinheiten. Diese Arginin-haltigen Motive (RKR) werden von zwei gegensätzlich wirkenden Interaktionspartnern erkannt: Einzelne bzw. unvollständig oder falsch zusammengelagerte Untereinheiten werden durch die COPI-Maschinerie zum ER zurückgeführt, während zytosolische 14-3-3-Proteine am Vorwärtstranport zur Plasmamembran beteiligt sind. Im Verlauf dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass 14-3-3-Proteine nicht nur spezifisch Kir6.2-Reporterproteine binden können, sondern dass diese Proteine am Transport des vollständigen, heterooktameren KATP-Kanalkomplexes beteiligt sind. Die Interaktion ist dabei eng an den Multimerisierungsstatus gekoppelt und involviert Aminosäurebereiche außerhalb der ER-Lokalisationssequenz in Kir6.2. Dabei ist die Aufgabe der 14-3-3-Proteine letztlich die Inaktivierung der Arginin-Signale in der Untereinheit SUR1, denn die Signale von Kir6.2 werden durch die korrekte Assemblierung mit SUR1 maskiert. Die 14-3-3-Proteine dienen dabei ausschließlich der Qualitätskontrolle und spielen keine Rolle beim Vorwärtstransport per se, denn sie haben keinen Einfluss auf den Transport des Kanals zur Zelloberfläche, wenn alle acht ER-Lokalisationssignale im KATP-Komplex mutiert sind. Die Untersuchung eines Kir6.2-Reporterproteins in Bäckerhefezellen, in denen jeweils nur eine von den insgesamt sieben Säuger-14-3-3-Isoformen exprimiert wird, deuten auf eine 14-3-3-Isoform-Spezifität beim Vorwärtstransport von Membranproteinen hin. So ist denkbar, dass verschiedene 14-3-3-Isoformen den Transport pankreatischer KATP-Kanäle in verschiedene Kompartimente regulieren, da diese offensichtlich hauptsächlich in Insulin-enthaltenden sekretorischen Vesikeln und nur in geringer Kopienzahl an der Plasmamembran präsent sind. Eine vergleichbare Aufgabe in der Qualitätskontrolle nehmen 14-3-3-Proteine bei den Zwei-Poren-Kaliumkanälen TASK1 und TASK3 ein. Hier erkennen 14-3-3-Proteine ein neu entdecktes Arginin-haltiges ER-Lokalisationssignal im C-Terminus der Kanalproteine und sind wie bei KATP-Kanälen für die Inaktivierung dieses Signals verantwortlich, woraufhin die Kanäle an die Plasmamembran transportiert werden können.