Der Krebsforscher Professor Peter Krammer vom Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg (DKFZ) hat eine Vision. Irgendwann wird vielleicht die Volkskrankheit Nummer eins, der Krebs, nicht mehr mit schwersten Pharmaka oder der Strahlentherapie behandelt, sondern mit leicht verträglichen Medikamenten, die den Körper selbst zur erfolgreichen Bekämpfung der Krankheit stimulieren. Es geht um den programmierten Zelltod, die so genannte Apoptose. Professor Peter Krammer erhielt dafür im Oktober 2003 den mit 250.000 Euro dotierten Lautenschläger-Forschungspreis der Universität Heidelberg. (Campus-TV, Mannheim, 2004)
Es wurde eine Meßtechnik entwickelt und optimiert, mit der zeitlich und räumlich hochaufgelöste T1-gewichtete MR-Bilder zur dynamischen MRT aufgenommen werden, so daß sowohl eine hohe Ortsauflösung als auch eine Auswertung mit einem Zweikompartimentemodell ermöglicht wird. Die auf einer FLASH-Sequenz basierte Technik wurde mit einer etablierten zeitlich hochaufgelösten SR-TFL-Technik verglichen. Die Ortsauflösung der neuen Methode ist mit (1,5×1,5×4) mm³ höher als die mit der SR-TFL-Technik realisierte Auflösung von (3,0×2,0×6) mm³. Dagegen erreicht die FLASH-Technik nur eine Zeitauflösung von dt = 43 s gegenüber dt = 23 s der SR-TFL-Technik. Simulationen zeigen, daß trotz schlechterer zeitlicher Auflösung auch die mit der FLASH-Technik aufgenommenen Daten stabil an ein pharmakokinetisches Modell angepaßt werden können. Der Grund ist das deutlich höhere SNR der neuen Methode, welches in Phantomexperimenten fünfmal und in-vivo 3,3-mal höher war als bei der SR-TFL-Technik. Im Tiermodell wurde die Technik zur Untersuchung von Angiogenese eingesetzt. Im untersuchten Tumormodell bestand zwischen dem Modellparameter A und der Mikrogefäßdichte (MVD) ein Zusammenhang, während kep keine Korrelation mit der MVD aufwies. Ein Vergleich von Gadomer-17 und Omniscan® im Modell der Ratte zeigte, daß die FLASH-Technik in Kombination mit einem makromolekularen KM, die Untersuchung der Permeabilität von Tumorgefäßen ermöglicht. Schließlich wurde die neue Meßtechnik in ersten Patientinnenuntersuchungen zur Verbesserung der räumlichen Auflösung in der MR-Mammographie angewendet.
Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist einer der am besten untersuchten Modellorganismen in der Entwicklungsbiologie. Die Kenntnis des Genoms und die Zahl der annotierten protein-kodierenden Gene von Drosophila sind jedoch Schwankungen unterworfen, da sie meist auf Computerberechnungen bereits bekannter Gene und nur teilweise auf experimentellen Nachweisen beruhen. Um das Transkriptom von Drosophila im Verlauf der Entwicklung zu untersuchen und neue potentielle Gene zu identifizieren wurde im Rahmen dieser Arbeit ein DNA-Microarray entwickelt, mit dem Veränderungen in der mRNA-Expression analysiert wurden. Auf der Grundlage einer neuentwickelten ab initio Genvorhersage im Rahmen einer Koorporation wurden spezifische Primer generiert, die eine Amplifikation der potentiellen Gene ermöglichten. Mit einem zweistufigen PCR-Protokoll konnten 20.948 (98%) PCR-Fragmente von 21.396 vorhergesagten Genen amplifiziert werden. Diese wurden als Basis für die Herstellung des Microarrays verwendet. So war es möglich die Vorteile computergestützter in silico- Berechnungen der möglichen Gene mit experimentellen Analysen zu kombinieren, um die Expression von Genen zu detektieren. Durch Optimierung der Protokolle und Methoden in der DNA-Chip-Konstruktion wurde ein hochdichter Microarray hergestellt, der nahezu das gesamte Transkriptom von Drosophila repräsentiert. Die Analyse differentiell exprimierter Gene erfolgte jeweils mit zwei RNA-Populationen die während der reversen Transkription mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und anschließend auf einem Microarray co-hybridisiert wurden. Es wurden Hybridisierungen mit der RNA aus 9 unterschiedlichen Entwicklungsstadien von Drosophila melanogaster durchgeführt, die den gesamten Lebenszyklus der Fliege umfassten. Nach der Quantifizierung der detektierten Signalintensitäten erfolgte die bioinformatische Datenanalyse mit unterschiedlichen Softwareprogrammen. Die Genexpressionsanalysen ergaben das 13.812 Gene im Verlauf der Entwicklung von Drosophila exprimiert werden, wovon ungefähr 2.500 bisher unbekannten Genen entsprechen. Es konnte außerdem gezeigt werden, daß die Entwicklungsstadien spezifische Regulationen von Genaktivitäten aufweisen, die mit morphologischen Veränderungen während der Entwicklung korrelieren und daß Gengruppen ähnlicher biochemischer oder physiologischer Funktion gemeinsam reguliert werden.
Im Rahmen dieser interdisziplinären Arbeit habe ich Methoden der Bildverarbeitung entwickelt, um reproduzierbare, quantitative Aussagen über dynamische Phänomene zu ermöglichen. Der Anwendungsschwerpunkt liegt im Bereich von Biologie und Medizin. Die verarbeiteten Daten stammen aus konfokalen Mikroskopaufnahmen, die biologischen Strukturen wurden mit fluoreszierenden Markern gefärbt. Aufgrund eines schlechten Signal-zu-Rausch Verhältnisses mußte ich robuste Verfahren entwickelt. Geeignete Vorverarbeitungsschritte waren nötig um die Qualität der Bilder zu erhöhen. Ich entwickelte ein Verfahren, um sowohl 2D- als auch 3D-Objekte mit aktiven Konturen in Bildern zu segmentieren. Dabei konnte ich in 2D zeigen, daß der Bereich der Attraktion der aktiven B-spline Kontur durch ein spezielles externes Kräftefeld erhöht werden konnte. Dies stellt einen Vorteil gegenüber den bisherigen parametrischen aktiven Konturen dar, besonders dann, wenn die Initialkurve weit von dem zu segmentierenden Objekt gelegt wird. In 3D wurde von mir eine Methode vorgestellt, um mehrere Objekte separat zu segmentieren. Hier setzte ich für diesen Spezialfall der Zellteilung einen Clusteralgorithmus ein, um zuvor extrahierte Kantenpunkte den Objekten zuzuordnen. Damit konnte ich die Volumen- und Oberflächenveränderung quantifizieren. Um segmentierte Objekte in beliebigen Dimensionen über die Zeit zu verfolgen, wurde von mir ein Particle-Tracking Algorithmus auf der Grundlage einer Fuzzy-Entscheidungslogik entwickelt. Eine Reihe von Anwendungen aus der biologischen Grundlagenforschung veranschaulichen die Wirkungsweise der entwickelten Methoden.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde versucht basierend auf einem Pflanzen-Virus-Vektorsystem verschiedene HPV16 rekombinante Viren herzustellen. Als Träger der HPV16-Sequenzen wurde die RNA-2 des Cowpea Mosaic Virus verwendet. Ziel war die billige Herstellungsweise einer anti-HPV16-Vakzine in Pflanzen (Vigna unguiculata) im großen Maßstab. Zu diesem Zweck wurden die HPV16-Gene L1 und E7 in das CPMV-Vektorsystem einkloniert und mit zwei unterschiedlichen Methoden in Pflanzen appliziert. Die ersten Experimente wurden mit der HPV16-rekombinanten cDNA-2 (RNA-2) mittels der mechanischen Inokulation durchgeführt. Mit dieser Methode konnte allerdings nur mit den Kontroll-Konstrukten (cDNA-2, cDNA-2-GFP) eine systemische CPMV-Infektion an Hand der Symptome beobachtet werden. Alle anderen Experimente mit den rekombinanten Konstrukten (HPV16L1) schlugen fehl. Auch ein effektiveres Inokulationssystem (Agrobakterien-Inokulation) resultierte abgesehen von den Kontroll-Konstrukten in keinem positiven Ergebnis. Innerhalb der oben beschriebenen Experimente sollte der Einfluss des Pflanzen-Kodon-optimierten HPV16E7 auf die Protein-Expression untersucht werden. Dies konnte allerdings aufgrund der negativen Ergebnisse in den Pflanzen nicht analysiert werden. Aus diesem Grund wurde der Einfluss des „Codon Usage“, allerdings mit den humanisierten HPV16-Genen E7 und L1 in DNA-Immunisierungs-Experimenten weiterverfolgt. Unterschiedlich modifizierte HPV16-DNA-Konstrukte wurden als DNA-Vakzine intramuskulär in Mäuse appliziert und mittels Elispot und Zytotoxizitätstest die zelluläre Immunantwort analysiert. In allen Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Humanisierung der HPV16-Gene den größten Einfluss auf die Immunogenität hat und dass die zusätzliche Fusion der Kozak-Sequenz am 5´-Ende der HPV16E7-Sequenzen eher einen geringen Einfluss ausübte. Als Hauptursache für die verbesserte Immunogenität der humanisierten E7-Konstrukte, im Vergleich mit dem unmodifizierten E7-Wild-Typ-Gen, wurde die erhöhte Translation und damit die verstärkte E7-Protein-Expression vermutet. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurden die modifizierten E7-Konstrukte in transienten Transfektion-Experimenten (293T-Zellen) analysiert. Vergleicht man nun die Daten aus den DNA-Immunisierungen und den Transfektionen, so erkennt man eine direkte Korrelation der verstärkten Expression in vitro und einer ebenso verbesserten Immunogenität in vivo. Dies gilt allerdings nur für die zelluläre Immunantwort und nicht für die humorale (ähnliche niedrige Antikörper).
Bestimmte Typen der humanpathogenen Papillomviren (HPV), z.B. HPV 16, sind ursächlich an der Entstehung von Gebärmutterhalskrebs und seinen Vorläuferläsionen beteiligt. Unter natürlichen Bedingungen erfolgt die Infektion mit HPV in undifferenzierten Epithelzellen des Stratum basale. Jedoch können infektiöse Papillomviren und durch Expression des Hauptstrukturproteins L1 hergestellte virus-ähnliche Partikel (virus-like particles, VLPs), aber auch das „minor“ Strukturprotein L2, an eine Vielzahl von Zellen binden und von diesen aufgenommen werden. Diese Eigenschaft sollte für eine DNA-Immunisierung genutzt werden in der Annahme, daß eine Induktion der Immunantwort effizienter sei, wenn ein Shuttle zum Eintritt der Nukleinsäure in Zellen eingesetzt wird. So könnte eine erhöhte Proteinexpresession in den getroffenen Zellen stattfinden. Die Freisetzung größerer Antigenmengen aus infizierten Zellen wie Muskel- oder Epithelzellen könnte vermehrt zu „cross-priming“ professioneller Antigen-präsentierender Zellen führen und dadurch oder durch direkte Infektion von Zellen des Immunsystems wie Dendritischen Zellen (DCs) die Präsentation des Antigens erhöhen. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Strukturproteine L1 und L2 des HPV Typs 16 diese Aufgabe erfüllen können. Zu diesem Zweck sollten drei verschiedene Vehikelpräparationen mit Ovalbumin als Reportergen hergestellt und getestet werden: (i) Pseudovirionen, bei denen die für das Antigen kodierende Reporter-DNA in HPV 16-VLPs verpackt ist, (ii) VLPs, an die das Reportergen von außen chemisch gebunden ist und (iii) ein Peptid von HPV 16 L2, an das das Reportergen gebunden vorliegt. Durch Dis- und Reassembly, bei dem in vitro DNA in VLPs verpackt wird, konnten Pseudovirionen hergestellt werden. Auch die Kopplung des Reportergens an VLPs war erfolgreich. Allein die Bindung zwischen dem HPV 16 L2-Peptid und dem Reportergen konnte nicht nachgewiesen werden. Trotzdem wurden alle Präparationen im Mausmodell auf ihre Immunogenität getestet. Die eingesetzte DNA-Menge pro Maus wurde als Standard gesetzt, um die Effizienz der verschiedenen Vehikelpräparationen vergleichen zu können. In einer intramuskulär (i.m.) durchgeführten DNA-Titration konnte festgestellt werden, daß eine Menge von mindestens 10 µg DNA benötigt wird, um eine meßbare zelluläre Immunantwort zu induzieren. Da die Vehikelpräparationen jedoch das maximale Volumen von 0,05 ml überschritten, das in einer i.m.-Injektion pro Maus eingesetzt werden kann, wurde außerdem die subkutane (s.c.) Route getestet. Bei dieser Applikationsart reichte sogar eine Menge von 100 µg DNA nicht aus, um eine meßbare Immunantwort hervor zu rufen. In der vergleichenden Immunisierung der Shuttle-Vektoren mit nackter DNA erhielt jede Maus über das Vehikel 3 µg DNA, eine Menge, die sich in der i.m. Titration als gerade nicht mehr immunogen erwies. Ein möglicher adjuvanter Effekt der VLPs bei einer Immunisierung mit Ovalbumin war vorher experimentell ausgeschlossen worden. So sollte getestet werden, ob durch Vehikel eingeschleuste DNA immunogener ist als nackte DNA. Eine Zunahme der Immunantwort im Vergleich zu nackter DNA konnte jedoch nicht festgestellt werden. Somit konnte die Hypothese, daß Vehikelpräparationen bestehend aus HPV 16-Strukturproteinen und für Ovalbumin kodierender DNA immunogener sind als nackte DNA, in dieser Arbeit nicht bestätigt werden.
In Experimenten an Modell-Lösungen und am lebenden Gewebe (in vivo) wurden die Spin-1/2-Systeme der körpereigenen Metaboliten Kreatin, Taurin, Citrat, Carnosin und Adenosin-5'-triphosphat (ATP) mit 1H-NMR-Spektroskopie bzw. 31P-NMR-Spektroskopie (für ATP) an einem konventionellen Ganzkörper-MR-Tomographen bei 1,5 T untersucht. Die Systeme weisen sowohl skalare als auch residuale dipolare Spin-Spin-Kopplungen verschiedener Stärken auf. Daraus resultieren unterschiedlich starke Drehungen der Eigenbasis eines 2-Spin-Systems, die den Spektren eine charakteristische Feinstruktur in Form veränderter Linienpositionen und -intensitäten aufprägen. Im Fall des Carnosins wurde durch Übertragung der Theorie der 1H-Hyperfeinstruktur auf das System zweier dipolar koppelnder Protonen-Spins eine verallgemeinerte Breit-Rabi-Gleichung hergeleitet, um die residuale Wechselwirkung zweier Ringprotonen des Moleküls nachzuweisen. Aus der Quantifizierung der dipolaren Kopplungsstärken konnte der Ordnungsparameter S verschiedener Molekül-Untereinheiten der Metaboliten bestimmt werden. Dadurch wurden qualitative Aussagen über die Molekulardynamik in vivo mit einer nicht-invasiven Technik möglich. Für ATP wurden aus der Feinstruktur die Clebsch-Gordan-Koeffizienten der gekoppelten Spins ermittelt, um eine Verbesserung der Quantifizierung hochaufgelöster 31P-NMR-Spektren der menschlichen Wade zu ermöglichen. Theoretische und experimentelle Betrachtungen zeigten, daß bei einer Grundfeldinduktion von 1,5 T für alle hier untersuchten Metaboliten der Übergang vom Zeeman- zum Paschen-Back-Effekt noch nicht vollständig stattgefunden hat und quantenmechanische Korrekturen - vor allem der Linienintensitäten - für hochaufgelöste Spektren nicht vernachlässigt werden können.
In many types of cancer, including cervical cancer, the nuclear retinoic receptor ß2 (RARß2) gene is epigenetically modified and unable to be significantly induced. RARß2 can act as a tumor suppressor, since loss of its expression is associated with human tumor progression. One mechanism of RARß2-mediated growth inhibition is based on its ability to constitutively repress the AP-1 transcription factor, but this mechanism has never been demonstrated in cervical cancer cells. In this thesis the biological consequences of reconstitute RARß2 receptor expression in cervical cancer cells was investigated. For this purpose, human papillomavirus HPV-18 positive HeLa cells were stably transfected with RARß2 cDNA under the control of the ß-actin promoter. The characterization of the RARß2 tranfectants revealed a strongly reduced AP-1 binding to the corresponding specific oligonucleotides, even in the absence of atRA treatment. In HeLa cells, the AP-1 reduction correlates with diminished HPV-18 oncogene transcription and slower cellular growth. Western blot analysis demonstrated that the only member of the AP-1 family consistently reduced in HeLa RARß2 clones was c-Jun, despite ongoing gene expression. In order to understand by which mechanism c-Jun is reduced, and since the phosphorylation of c-Jun is important for protein stabilization, HeLa RARß2 clones were treated with different c-Jun-N-terminal kinase (JNK) stimulators. The treatments resulted in a c-Jun increase at RNA and protein levels, and led to a reconstitution of AP-1 binding similar to non-transfected HeLa controls. However, the reconstitution of AP-1 binding levels did not have an inductor effect on the HPV-18 oncogenes, the expression of which has been postulated to be AP-1 dependent. Other classical AP-1 regulated genes such as metalloproteinases were up regulated as expected. In conclusion, the data of this thesis indicate that RARß2 induced a destabilization and accelerated degradation of c-Jun at the protein level responsible for the AP-1 reduction. The mechanism of AP-1 trans-repression in HeLa cells is different from that postulated for other cancer cell models. All changes produced in HeLa cells after RARß2 constitutive expression lead to reduced cell proliferation, which can be associated with the RARß2 tumor suppressor function.
Das multifunktionale große Nichtstruktur Protein NS1 des autonomem Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) wird posttranslational modifiziert und zumindest teilweise über Phosphorylierung reguliert. Aufgrund seiner enzymatischen Funktionen, wie die ATPase-, Helikase- und Nickase-Aktivitäten ist NS1 essentiell für die Initiierung der viralen Replikation. NS1 ist außerdem in der Lage, heterologe Promotoren zu transregulieren und wirkt zytotoxisch auf die Wirtszelle. Die atypische PKClambda -Isoform phosphoryliert und aktiviert NS1 für Helikase-Funktionen. Diese Aktivierung allein ist jedoch nicht ausreichend, um das virale Protein für die rollende Haarnadelreplikation (rolling circle replication) in vitro zu stimulieren. In der vorliegenden Arbeit konnte eine weitere zelluläre Kinase, PKCeta, identifiziert werden, die NS1 in vitro phosphoryliert und so das virale Polypeptid zusammen mit PKClambda für die rolling circle Replikation stimuliert. Diese Funktion von PKCeta wurde mittels in vivo Analysen bestätigt. Dazu wurde die permissive Maus-Fibroblastenzellinie, A9, stabil mit Flag-Epitop markierten Mutanten transfiziert, die die endogene PKCeta -Aktivität modulieren. Es resultierten A9 Derivat-Zellinien mit konstitutiv aktiver oder Kinase-inaktiver PKCeta. Eine tryptische Phosphopeptid-Analyse von 32P-markiertem NS1 ergab, daß in Gegenwart einer dominant negativen PKCeta-Mutante distinkte Phosphorylierungsereignisse ausblieben. Diese Beobachtung korrelierte mit einer defizienten Synthese an viralen DNA-Replikationsintermediaten der Gesamtzellpopulation im Southern Blotting sowie auf Einzelzellebene mittels BrdU-Inkorporation. Die Ergebnisse belegen damit die Bedeutung der PKCeta -Phosphorylierungen von NS1 für die Stimulierung der parvoviralen Replikation. Interessanterweise löst die MVM-Infektion eine Akkumulierung endogener PKCeta in der nukleären Peripherie aus, was als Zeichen der intrazellulären Aktivierung interpretiert wird. Folgerichtig konnte durch Expression einer Kinase-inaktiven Mutante der PKC-aktivierenden upstream-Kinase PDK-1 diese Translokation von endogener PKCeta nach MVM-Infektion unterbunden werden. Außerdem konnte mittels Fraktionierung gezeigt werden, daß ein Zusammenhang zwischen der PKCeta -Aktivität und der Verteilung der Ezrin Radixin Moesin (ERM) -Proteine in vivo besteht, die mit PKCeta aus einem NS1-aktivierenden zellulären Extrakt über mehrere chromatographische Schritte zusammen aufgereinigt worden waren. Darüberhinaus kolokalisierte Radixin in Immunfluoreszenzanalysen mit den PKCeta-Vollänge-Mutanten an der Plasmamembran. Daraus wurde geschlossen, daß die ERM-Proteine eine Rolle beim Transport von PKCeta zur Plasmamembran spielen könnten. Durch Immunpräzipitation wurde eine spezifische Interaktion zwischen Radixin und der Kinase-inaktiven PKCeta T512A gezeigt, deren funktionelle Relevanz jedoch noch nicht geklärt ist. Da die beobachtete Aktivierung von PKCeta zu Zeitpunkten auftritt, an denen die virale Replikation bereits weit fortgeschritten ist, liegt die Vermutung nahe, daß die Kinase hier möglicherweise weitere, für den viralen Vermehrungszyklus vorteilhafte, Funktionen erfüllt. Es wurde angenommen, daß MVM dieselben Kinase-Aktivitäten, die es zur Initiierung der viralen DNA-Replikation benötigt, auch für die Virus-induzierten morphologischen- und Zytoskelettveränderungen der Wirtszelle ausnutzen könnte. Aus diesem Grund wurden die nach Infektion auftretenden Zytoskelettalterationen anhand von Markerproteinen in der murinen Wirtszelle A9 sowie den Derivaten mit modulierter PKCeta-Aktivität untersucht und miteinander verglichen. So konnten die beobachteten Strukturveränderungen der Wirtszelle erstmals konkret auf Modifikationen der Mikrofilamente sowie Intermediärfilamente zurückgeführt werden. Eine Rolle für PKCeta in diesen Abbau- und Deassemblierungs-vorgängen konnte allerdings nicht gezeigt werden.
The work presented here demonstrates rules of and validates models for nuclear body (NB) dynamics. Simulation tools developed in the course of this work can be used in future work to generate hypotheses about related aspects of nuclear architecture. Initially I examined the mobility of vimentin nuclear bodies bodies (VNB) in interphase by single particle tracking and analysis of fluorescence images from 4-D confocal laser scanning microscopy (CLSM). These synthetic nuclear bodies are observed in cells transfected with labelled nuclear-targeted Xenopus laevis vimentin. Analysis shows that VNBs undergo anomalous diffusion in the nuclei, independent of metabolic energy. Individual bodies display either one of the three modes of diffusion -- directed, restricted or simple. The consistency of modes and magnitudes of diffusion constants between VNBs and bona fide nuclear bodies points to a generic mechanism that mediates and regulates the mobility of nuclear bodies. Since the results of diffusion analysis of VNBs did not agree with a simple diffusion model, I tested the alternative interchromosomal domain (ICD) compartment model. The ICD model predicts that in interphase cell nuclei, individual decompacted chromosomes do not intermingle, but are separated by a significant interchromatin space forming a network of channels. These networks could affect the mobility of nuclear bodies. Monte Carlo simulations that predict the effects of channels and other obstructions on NB diffusion were tested, but they could not explain deviation from ideal behaviour. Fitting an empirical model of `critical diffusion' produced similar results. Therefore the ICD model as a purely obstructing network of channels needs modification, to possibly include binding. To examine the role of chromatin density in intra-nuclear diffusion, I employed multidimensional fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in living cells. The influence of chromatin density on diffusive mobility of the nuclear yellow fluorescent protein (YFP) appears marginal. A 2-D diffusion simulation to better characterize the experiment provides a tool to produce `diffusion maps' of the nucleus. The related aspect of nuclear body integrity and dynamics was examined for the distribution of topoisomerase II beta (TopoIIb), which localizes preferentially in the nucleolus. The experimentally observed diffusion and binding dynamics were formulated as a compartment model and fitted to the experiments. The model topology, flux constants and residence times estimates could be validated, providing a predictive model of TopoIIb dynamics By demonstrating that VNB diffusion is anomalous and consistent with other bona fide NBs, I have revealed a mechanism that regulates NB mobility. The diffusion of these bodies deviates however from ideal diffusion, and can be explained by neither the effect of chromatin density on molecular diffusion, nor the different models of NB diffusion. I have shown that binding rather than diffusion appears to determine nuclear body localization and dynamics, as in the case of TopoIIb. Nuclear bodies and nuclear architecture has been recently hypothesized as emerging from simple local interactions. The predictive model for TopoIIb distribution dynamics provides evidence for this. The models presented here, are in keeping with the increasing trend to abstract nuclear dynamics as mathematical models. It is hoped that the work presented here will contribute to the effort of arriving at an integrated model for nuclear bodies and therefore better understanding nuclear architecture.
High-risk Papillomviren des Menschen (z.B. HPV16) stellen das ätiologische Agens von Gebärmutterhalskrebs (Zervixkarzinom) und dessen Vorstufen dar. Das Zervixkarzinom ist weltweit der dritt häufigsten Krebs bei Frauen. Trotz chirurgischer Entfernung des Tumors und einer anschließenden Kombination aus Strahlen- und Chemotherapie entwickeln 35% der Patientinnen Rezidive, für die heute keine effektive Therapie existiert. In der Pathogenese von HPV-assoziierten zervikalen Läsionen spielt die zelluläre Immunantwort eine große Rolle, was die Möglichkeit einer therapeutischen Vakzinierung bietet, welche die Progression von HPV-assoziierten Läsionen verhindern und eine Regression der Läsionen bedingen sollte. Einen potentiellen therapeutischen Impfstoff stellen HPV16 chimäre virus-like particles (CVLPs) dar, bestehend aus dem C-terminalen verkürzten Hauptkapsidprotein L1 und Teilen des E7 Proteins (HPV16L1CE7). E7 ist in Zervixkarzinomzellen konstitutiv exprimiert und wird deshalb als potentielles Tumorantigen angesehen. CVLPs erwiesen sich in präklinischen Studien als immunogen, doch eine noch nicht abgeschlossene klinische Studie zeigte, dass die Immunogenität von CVLPs beim Menschen noch verbessert werden muß. In dieser Arbeit sollte daher die Immunogenität von CVLPs im Maus-Modell moduliert werden, um so möglicherweise auch Verbesserungsansätze für die Anwendung beim Menschen zu schaffen. Dazu wurden Dendritische Zellen (DCs) aus dem Knochenmark der Mäuse (BMDCs) präpariert und mit CVLPs entweder als Immunkomplexe (CVLP-ICs) oder in Kombination mit unmethylierten Cytidin-Phosphat-Guanosin Oligodinukleotiden (CpG ODNs) beladen. Zudem wurden CVLP-beladene BMDCs durch Sorbitol hyperosmotischem Streß ausgesetzt, eine Methode, die in dieser Arbeit erstmalig beschrieben wird. Obwohl CVLP-ICs ähnlich wie CVLPs BMDCs zur Reifung induzieren konnten, stellten sie sich im Gegensatz zu CVLPs sowohl bei der cross Präsentation wie auch bei der Generierung von zytotoxischen T-Lymphozyten auch bei geringen Mengen als sehr immunogen heraus. Dieser Unterschied beruht nicht auf der Nutzung unterschiedlicher MHC Klasse I Präsentationswege, da beide Antigene in einen gemeinsamen, ungewöhnlichen Weg eingeschleust wurden, welcher transporter of antigen presentation (TAP)-unabhängig, jedoch Brefeldin A-sensitiv war. CpG ODNs konnten die Immunogenität der CVLPs verbessern, allerdings nur dann, wenn sie vier Stunden nach CVLP-Beladung auf BMDCs geladen wurden. Die Sorbitol-Behandlung führte bei CVLP-beladenen BMDCs ebenfalls zu einer Steigerung der Immunogenität. BMDCs erwiesen sich nicht nur als Bestandteil der Methoden zur Überprüfung der Immunogenität als sehr effizient, sondern auch als ‚nature’s adjuvans‘ und führten so ebenfalls zu einer Verbesserung der Immunogenität der CVLPs. Dabei wurden Mäuse mit BMDCs immunisiert, die ex vivo mit CVLPs, CVLP-ICs bzw. CVLPs in Kombination mit CpG ODNs beladen wurden bzw. mit CVLPs beladen und dann mit Sorbitol behandelt wurden. Die hier im Maus-Modell gezeigten Strategien zur Verbesserung der Immunogenität von CVLPs könnten möglicherweise auch beim Menschen Anwendung finden und so eine effektive therapeutische Vakzinierung gegen das Zervixkarzinom und seine Vorstufen darstellen.
In dieser Arbeit wird ein neuartiges System zur Kontrolle der Lamellenpositionen in einem Multi-Leaf-Kollimator (ModuLeaf MLC, MRC Systems, Heidelberg) für die intensitätsmodulierte Strahlentherapie (IMRT) vorgestellt. Eine in 400 Kanäle segmentierte flüssigkeitsgefüllte Ionisationskammer erreicht eine Ortsauflösung besser als 1 mm, bezogen auf das Isozentrum, in der Bewegungsrichtung der Lamellen, mit der die Form der Kollimatoröffnung in Echtzeít kontrolliert werden kann. Die Ionisationskammer wurde in Zusammenarbeit mit dem Forschungszentrum Karlsruhe (FZK) entwickelt und gebaut. Weitere Untersuchungen wurden angestellt, um eine geeignete Flüssigkeit als sensitives Medium der Ionisationskammer zu finden. Eine geeignete Elektronik, mit der die Kammersignale (wenige nA) gemessen werden können und eine passende Datenauslese wurden zusammengestellt. Das Potential des Systems zur Verbesserung der Qualitätssicherung in der IMRT wird diskutiert.
In dieser Arbeit wurde geprüft, inwieweit sich rekombinante, autonome Nagerparvoviren, die als Vektoren für den Einsatz in der Tumor-Gentherapie entwickelt wurden, von ihren ursprünglichen Wildtyp Viren unterscheiden und wie sich ihre Wirksamkeit in vivo darstellt. Die Charakterisierung der Vektoren zeigte, dass bei gleicher Partikelanzahl die rekombinanten Viren weniger infektiös waren als Wildtyp Viren. Bei gleicher Infektiösität wiesen rekombinante Parvoviren im Vergleich zu Wildtyp Viren zwar eine geringere virale Zytotoxizität auf, die Proteinexpression stimmte jedoch bei beiden überein. Somit ist eine wichtige Voraussetzung für einen effizienten Gentransfer mit rekombinanten Parvoviren erfüllt. Zur Untersuchung der Wirksamkeit in vivo wurde zum einen die antivirale Immunantwort in C57Bl/6 Mäusen analysiert, die mit MVMp Wildtyp Viren infiziert wurden. Infizierte Mäuse entwickelten eine ausgeprägte humorale, dagegen aber eine sehr geringe zelluläre Immunantwort gegen das Virus. Aufgrund der Virus neutralisierenden Aktivität dieser Antikörper ist bei einer Zweitinfektion desselben Virus ein massiver Verlust des Therapieerfolgs zu vermuten. Durch Pseudotypisierung des Virus in ein verwandtes Viruskapsid konnte jedoch einer Neutrali-sierung des Virus vorgebeugt werden. Die präferenziell induzierten Antikörper des IgG2a und IgG3 Isotyps durch die virale Infektion lässt eine Immunantwort des Th1 Typs vermuten, die bei einer Tumortherapie unterstützend wirken sollte. Zum anderen wurde die Anwendung rekombinanter Parvoviren, die die immunstimulierenden Zytokingene IL-2, MDC (Makrophagen-abgeleitetes Chemokin) oder IP-10 (Interferon--induziertes Protein 10) tragen, in dem Tumormodell RENCA/Balb/c Maus untersucht. Dabei konnten deutliche antitumorale Effekte verzeichnet werden. Im Blickpunkt der Untersuchung stand die Prüfung einer Kombinationstherapie des IL-2 transduzierenden Virus MVMp/IL-2 mit einem der beiden Chemokin transduzierenden Viren MVMp/MDC oder MVMp/IP-10, die immunologische Effektorzellen anzulocken vermögen. Es konnte allerdings kein synergistischer antitumoraler Effekt beobachtet werden. Insgesamt lassen die Ergebnisse auf eine wirksame Anwendung rekombinanter Parvoviren in der Tumor-Gentherapie schließen. Die erfolgreiche Tumor-Immunisierung mit Wildtyp Viren im Mastozytom Modell zeigt auch Perspektiven in der Anwendung rekombinanter Parvoviren in der Tumorzellvakzinierung.
Zur stereotaktischen und intensitätsmodulierten Strahlentherapie von Tumoren ist eine präzise Patientenpositionierung – aufgrund steilerer Gradienten der Dosisverteilung – essenziell. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Implementierung eines hochpräzisen, ?exiblen Stereokamerasystems zur Detektion von patientenfesten, kugelförmigen Markierungen zur videobasierten Patientenpositionierung. Hierzu berechnen wir 3D Positionen dieser Markierungen, die durch ein mathematisches Kameramodell – unter Berücksichtigung der radialen und tangentialen Linsenverzeichnung – beschrieben werden. Um die gewünschte Präzision zu erreichen, wurde ein neues Kalibrierphantom entwickelt und konstruiert. Es erlaubt eine geometrische Vor-Ort Kamerakalibrierung, was sehr vielseitige Anwendungen ermöglicht. Die Parameter, die im Kameramodell verwendet werden, stammen aus diesem Kalibrierverfahren. Zusätzlich erleichtert das Phantom eine regelmäßige Qualitätssicherung (QA) des Kamerasystems, da für den medizinischen Anwendungsfall die tägliche Einsatzfähigkeit gewährleistet und auch überprüfbar sein muss. Für den klinischen Einsatz des Stereokamerasystems werden zwei Anwendungen betrachtet. Einerseits steht die automatisierte Patientenpositionierung am Bestrahlungsgerät zur Diskussion. Andererseits wird eine vorbereitende Studie zur Echtzeitüberwachung der Patientenbewegung während der Bestrahlung präsentiert.