Zell-Zell-Verbindungen ("Junctions") der Adhaerens-Kategorie sind durch zelltypische Kombinationen von Transmembran-Glykoproteinen der Cadherin-Großfamilie und damit assoziierten cytoplasmatischen Plaque-Proteinen bestimmt, die meist Actin-Mikrofilamente verankern. Sie stellen Hauptstrukturelemente des spezifischen Gewebe-Aufbaus und Zusammenhalts dar und sind darüberhinaus auch an vielen dynamischen Zellfunktionen beteiligt. In den letzten Jahren hatte sich zunehmend deutlicher herausgestellt, dass viele "Adhering Junction" (AJ) besonderer Zelltypen nicht unter die bisher bekannten Klassen bzw. Typen von AJ subsumieren lassen, sondern aufgrund ihrer Struktur, vor allem aber ihrer besonderen molekularen Zusammensetzung eigene Strukturtypen sui generis darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit sind zwei AJ-Typen menschlicher Zellen und Gewebe in ihrer molekularen Zusammensetzung bestimmt worden, wobei Untersuchungen an Zellkulturen sowie zellbiologische, biochemische, immunologische und molekularbiologische Methoden benutzt wurden. Astrocytom-Zellen, auch Astrocyten, und Glioblastom-Zellen bilden viele AJ unterschiedlicher Größe aus, die durch einen recht kompakten Plaque ausgezeichnet sind und die Cadherine N-Cadherin, Cadherin-11 sowie in einigen Zellkolonien immer wieder auch VE-Cadherin enthalten, die auf der Binnenseite mit den Plaque-Proteinen alpha- und beta-Catenin, den weiteren armadillo-Proteinen p120ctn, ARVCF und Plakoglobin sowie - überraschenderweise - dem von Desmosomen her bekannten Protein Plakophilin 2 und den - von "Tight Junctions" bekannten - Plaque-Proteinen ZO-1, ZO-2 und Cingulin komplexiert sind und zusammen mit Afadin und dem Actin-bindenden Protein Vinculin Mikrofilament-Bündel des Actin-Typs verankern. Molekulare Interaktionen innerhalb dieser Struktur werden aufgrund erster Immunpräzipitations-Ergebnisse ebenso diskutiert wie die mögliche Bedeutung dieses AJ-Typs, dem der Name Colligatio permixta gegeben wurde, in Embryologie, Histologie und Pathologie. Dabei ist das spontane klonale Auftreten einer Unterform, die das - erstmals außerhalb von Gefäß-Endothelien nachgewiesene - VE-Cadherin enthält, auch deshalb von besonderem Interesse, weil der Astrocyt - gewissermaßen seiner natürlichen Position nach - oft eine räumliche wie funktionale Beziehung zu Blutgefäßen, besonders Kapillaren erkennen lässt. Neue tumordiagnostischen Möglichkeiten wie entwicklungsbiologischen Implikationen der Entdeckung dieses neuen Junction-Typs werden besprochen. Gleichzeitig ist in Kulturen bestimmter menschlicher Knochenmarkzellen, sogenannter "mesenchymaler Stammzellen", ein anderer - in seiner molekularen Zusammensetzung äußerst schlichter - AJ-Typ entdeckt worden, der ebenfalls N-Cadherin und Cadherin-11 in Verbindung mit signifikanten Mengen der Plaque-Proteine alpha- und beta-Catenin, Protein p120ctn und Afadin enthält und vielfach auch Actinfilament-Bündel verankert. Dieser AJ-Typ erscheint in der Regel in Form kleiner Puncta adhaerentia (Durchmesser meist im Bereich 30-200 nm), wobei diese sowohl am eigentlichen zentralen Zellkörper als auch auf tentakel-artigen Zellausläufern verschiedener, teils sehr großer Länge (bis über 400 µm lang) vorkommen, die einerseits durch Actinfilament-Bündel in Verbindung mit Ezrin, alpha-Actinin und Myosin stabilisiert sind, andererseits aber auch Mikrotubuli enthalten. Solche Zellausläufer (Processus adhaerentes) können dabei sowohl über durch Puncta hergestellte Brückenstrukturen mit Ausläufern anderer Zellen verbunden sein, andererseits aber auch tief und eng in entsprechenden, z.T. sehr häufigen und langen (bis über 40 µm) Invaginationen von Nachbarzellen verankert sein, wobei die AJ-Regionen der Puncta beider Zellen gewissermaßen zu einer riesigen Doppelhülle (Manubrium adhaerens) fusioniert sein können. Hinweise auf ein Vorkommen solcher Processus adhaerentes in der Embryogenese und mögliche biologische Funktionen solcher Strukturen werden ebenso besprochen wie Einsatzmöglichkeiten und mögliche Bedeutung in der Diagnostik.
Das Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Funktion von RGS5 in der Karzinogenese und bei der Blutdruckregulation. Wir definieren den G-Protein-Regulator RGS5 als neuen Perizytenmarker in einem murinen b-Zellkarzinom-Modell. Während der Tumorentwicklung wird RGS5 in einer PDGFRb+-Perizytensubpopulation zeitgleich mit der Gefäßneubildung induziert. RGS5 kennzeichnet eine unreife Perizytenform, die ein therapeutisch relevantes Angriffsziel in der Antiangiogenese-tumortherapie darstellt. Die Expression von RGS5 erfolgt auch in normalen Geweben, in denen eine aktive Gefäßneubildung stattfindet. Dies wird im Granulationsgewebe subkutaner Hautwunden, als auch im Ovar demonstriert. Die Angiogeneseabhängigkeit der RGS5-Expression wird weiterhin in therapierten Tumoren gezeigt. So wird RGS5 in soliden Tumoren im Verlauf einer Tumortherapie mit der Hemmung der Angiogeneseprozesse herunterreguliert, wobei gleichzeitig eine Normalisierung der Tumorgefäßstruktur stattfindet. Die Expression von RGS5 korreliert daher nicht nur mit dem Einschalten der Angiogenese, sondern auch mit ihrem Ausschalten. Die RGS5-Induktion in Tumorperizyten verdeutlich, dass nicht nur Endothelzellen während der Tumorangiogenese molekulare Veränderungen erfahren, sondern dass Perizyten gleichsam diesem Wandel unterworfen sind. Sie sind damit für die Tumortherapie außerordentlich bedeutsam. Die RGS5-Menge wird auf der Transkriptionsebene und über die Degradationsrate reguliert. Wir demonstrieren, dass RGS5 in vivo sehr instabil ist und schnell über den proteasomabhängigen „N-End“-Weg abgebaut wird. Zudem wird RGS5 in äußerst geringen Mengen endogen exprimiert. Die präzise Koordination der Synthese- und Abbaurate ermöglicht eine schnelle Adaptation in einer wechselnden Mikroumgebung, wie dies während der Tumorentwicklung der Fall ist. Durch 2-Hybridscreening identifizieren wir unter anderem die Adenylatzyklase 3, die in vaskulären SMC ebenso wie RGS5 Hauptwege der Proliferation, Migration und Kontraktion inhibiert. Möglicherweise wird der Gefäßtonus, der durch die Kontaktion der SMC bestimmt wird, synergistisch durch RGS5 und die Adenylatzyklase gesteuert. Tumorgefäße in RGS5-/--Tieren unterscheiden sich grundlegend von RGS5-positiven Tumorgefäßen. Sie erscheinen „normalisiert“ und ähneln Normalgefäßen oder Gefäßen in therapierten Tumoren. In Abwesenheit von RGS5 wird infolgedessen ein Normalisierungsprozess induziert. Als Teil einer neuen Antiangiogenesetherapie ist die Normalisierung gegenwärtig von großen Interesse. RGS5-/--Tiere weisen Plazentadefekte und eine verzögerte Gefäßneubildung während der Wundheilung auf. Das Fehlen von RGS5 ist von einer erhöhten prä- und postnatalen Sterblichkeit begleitet, die mit den beobachteten Gefäßanomalien in Zusammenhang stehen könnte. Erstmals zeigen wir, dass RGS5 an der Relaxation der Widerstandsgefäße, sowie an der NO-vermittelten Relaxation der Aorta, beteiligt ist. Wir vermuten, dass RGS5 für die Gefäßintegrität wesentlich ist und eine wohlmöglich kritische Rolle bei der Regulation des Blutflusses spielt.
HINTERGRUND: Damit Tumorantigen-spezifische T-Zellen Tumorzellen spezifisch erkennen und zerstören können, müssen sie zuvor durch professionelle Antigen-präsentierende Zellen, wie den Dendritischen Zellen (DC) aktiviert werden. Neuere Therapiekonzepte konzentrieren sich deshalb auf den Einsatz von Tumorantigen-beladenen DC als Vakzine. ZIEL: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Elektroporation von DC mit RNA zu etablieren und die T-Zell-stimulatorischen Eigenschaften RNA-elektroporierter DC zu analysieren. METHODEN UND ERGEBNISSE: Die RNA-Elektroporation wurde für dendritische Zellen, sowie für andere Antigen-präsentierende Zellen etabliert. Die Analyse der T-Zell-stimulatorischen Kapazität RNA-elektroporierter DC erfolgte nach Elektroporation von RNA, kodierend für das immunodominante pp65 Antigen des humanen Cytomegalievirus. Es konnte eine effiziente Stimulation pp65-spezifischer CD8+-T-Zellen erzielt werden. Die Fähigkeit, RNA-elektroporierter DC eine spezifische Stimulation von CD4+-T-Zellen zu vermitteln, wurde im Tumormodell untersucht. DC wurden mit der RNA des Tumorantigens Melanotransferrin (Mtf) elektroporiert und mit T-Zellen, spezifisch für das erst kürzlich identifizierte HLA-DRB1*0401-präsentierte Mtf668-683-Epitop, inkubiert. Eine spezifische Stimulation der T-Zellen durch Mtf-RNA-elektroporierte DC konnte detektiert werden. Weiterhin wurde die Präsenz des Mtf668-683-Epitops in gesunden Donoren und Melanompatienten analysiert. Dabei wurden Epitop-spezifische T-Zellen in beiden Gruppen nachgewiesen. Die erzielten Daten zeigen demnach, dass RNA-elektroporierte DC Antigen-spezifische T-Zellen effizient stimulieren können, so dass ihr Einsatz in Rahmen von Antigen-spezifischen Vakzinierungsstrategien denkbar ist.
Hirntumore, wie das Glioblastom multiform (GBM), zählen zu den häufigsten und bösartigsten Tumoren des zentralen Nervensystems (ZNS). Trotz sich weiterentwickelnder Diagnosemöglichkeiten ist die Überlebensrate sehr gering. Weniger als 3% der Patienten überleben die ersten 5 Jahre nach der Diagnose. Der klinische Verlauf bösartiger Glioblastome ist von der Invasion isolierter Tumorzellen in das normale Gehirngewebe abhängig. Diese Zellen entkommen der operativen Entfernung des Tumors. Sie sind Ziel der postoperativen Strahlen- und Chemotherapie. Diese postoperativen Therapieformen induzieren Apoptose durch Induktion der Expression der Todesrezeptoren und ihrer Liganden, wie beispielsweise das CD95-(Fas/Apo-1) Todessystem. In den letzten 20 Jahren wurden immer wieder neue Therapieformen entwickelt, die oftmals aber einen gegenteiligen Effekt erzielten. So führten beispielsweise die Antiangiogenese Medikamente zu einem verstärkten Auswachsen der Zellen aus dem Glioblastom (Lamszus et al., 2003). Ein weiteres Problem ist die zunehmende Resistenz der Glioblastome gegenüber apoptoseinduzierender Therapien. Das Anliegen dieser Studie war den Mechanismus der Invasion genauer zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die Stimulierung des CD95-Rezeptors einen Anstieg der Migration/Invasion in apoptoseresistenten etablierten und primären Glioblastomzellen auslöste. Diese Zunahme konnte sowohl mit exogenen Stimuli (α-Apo-1 Antikörper bzw. LZ-CD95L) als auch durch die Hochregulierung des endogenen CD95/CD95L-Systems nach -Bestrahlung beobachtet werden. Der CD95-vermittelte Anstieg konnte durch einen neutralisierenden Antikörper gegen CD95L blockiert werden. Die Tendenz der Zellen zu migrieren, anstatt durch Apoptose zu sterben, steigt mit dem Malignitätsgrad primärer Glioblastome an. Der Signalweg der CD95-vermittelten Migration läuft über die Aktivierung der PI3Kinase (PI3K), der Integrin-Linked-Kinase (ILK), der Inhibierung von GSK3 und der Expression der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Caspasen sind an diesem Signalweg nicht beteiligt. Das direkte Verbindungsglied unterhalb des CD95-Rezeptors konnte in dieser Studie nicht detektiert werden. Das „phosphoprotein enriched in diabetes/phosphoprotein enriched in astrocytes-15-kDalton“ (PED/PEA-15) wurde als möglicher Kandidat untersucht. Jedoch konnte nach dem Ausschalten der PED/PEA-15-Expression keine Veränderung in der Inhibierung von GSK3 detektiert werden. Vor diesem Hintergrund sollten die postoperativen Therapieformen sehr gut überlegt und durch vorherige Test des entnommen Tumors auf seine Reaktion gegenüber CD95-Stimulierung getroffen werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass bei Mammakarzinompatientinnen, die bereits verschiedenste systemische, zytostatische und/oder endokrine Therapien durchlaufen haben, Tumor-reaktive Gedächtnis-T-Zellen im Knochenmark (KM) nachweisbar sind. Allerdings konnte insbesondere nach neoadjuvanter und adjuvanter Chemotherapie eine deutliche Reduktion der Frequenz Tumor-reaktiver Gedächtniszellen festgestellt werden. Aus dem hier entwickelten Modell zur Testung des Einflusses von Zytostatika auf separierte T-Zellpolulationen in vitro ging hervor, dass durch die eingesetzten Zytostatika selektiv die Vitalität Teilungs-aktiver Gedächtnis-T-Zellen limitiert wurde. Obwohl derzeit nicht geklärt ist, in welchem Aktivierungszustand Tumor-reaktive T-Zellen im KM von Mammakarzinompatientinnen vorliegen, legen die hier erbrachten Untersuchungen einen direkt schädigenden Einfluss systemisch applizierter Chemotherapeutika auf das Tumor-reaktive Gedächtnis-T-Zellreservoir nahe. Bei Patientinnen im fortgeschrittenem Stadium der Erkrankung (palliative Situation) wurde ein weiterer Rückgang Tumor-reaktiver KM-T-Zellen festgestellt, so dass bei weniger als 25 % der untersuchten Fälle eine tumorspezifische Reaktivität im KM nachgewiesen werden konnte. Diese letztgenannten Patientinnen bildeten die Kandidaten für die in dieser Arbeit etablierte Immuntherapie beim metastasierten Mammakarzinom mittels autologer Tumor-reaktiver KM Gedächtnis-T-Zellen im Rahmen einer klinischen Phase I Studie. Die qualitative Analyse der 72-stündigen Stimulationskulturen Patienten-eigener KM-T-Zellen mit autologen TAA-gepulsten dendritischen Zellen wies auf eine effektive Aktivierung und Expansion therapeutisch wirksamer Zellen ex vivo hin. Nach adoptivem Transfer kam es bei fünf von elf behandelten Patientinnen zu einer massiven Expansion Tumor-reaktiver T-Zellen in vivo, was sich in einer erstmalig detektierbaren tumorspezifischen T-Zellreaktivität sieben Tage nach Applikation im peripheren Blut manifestierte. Dieser Therapieeffekt, der mit der Anzahl applizierter Tumor-reaktiver Zellen und mit dem Erkrankungsstadium der Patientin assoziiert war, wurde als ADI-Reaktivität interpretiert. Zusätzlich konnte eine Therapie-induzierte Mobilisierung Tumor-reaktiver T-Zellen aus dem KM bei ADI-reaktiven Patientinnen beobachtet werden, während ein klinisches Ansprechen nicht ausreichend evaluierbar war. Insgesamt war die hier erstmalig durchgeführte Therapie praktikabel und gut verträglich. Beim Malignem Melanom konnten Tumor-reaktive Gedächtnis-T-Zellen mit Hilfe autologer dendritischer Zellen, die zuvor mit Melanom-assoziierten Tumorantigenen beladen worden waren, zu gleichen Teilen im KM und Blut nachgewiesen werden. Allerdings korrelierte eine detektierbare tumorspezifische Reaktivität nur im KM mit einer nachweisbaren Tumormanifestation sowie dem Krankheitsstadium der untersuchten Patienten. Tumor-reaktive KM-T-Zellen waren hier ausschließlich im Spätstadium (Stadium IV) der Erkrankung nachweisbar und mit einer signifikant längeren Krankheitsdauer der reaktiven Patienten assoziiert. Dies könnte auf eine prognostische Bedeutung Tumor-reaktiver KM-T-Zellen beim Malignen Melanom hindeuten.
Das zentrale Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung einer durch ein potentielles HIV-Vakzin induzierten Immunantwort, welches auf konformationellen Env-Epitopen basiert, die durch die Interaktion mit dem zellulären Rezeptorkomplex (CD4/CXCR-4) induziert werden. In unserer Arbeitsgruppe wurde bereits gezeigt, dass Pseudovirionen (PV) mit eingebauten HIV-Env- bzw. CD4/CXCR-4-Molekülen eine Env-vermittelte Fusion miteinander eingehen können. In dieser Arbeit wurde ein Env- und CD4/CXCR-4-PV-Gemisch in einer Zwischenphase der Fusion fixiert, während derer induzierte Env-Epitope exponiert werden, und die induzierte Immunantwort nach Immunisierungen von Versuchstieren mit diesem PV-Vakzin analysiert. Am Anfang dieser Arbeit wurden Versuche zur Charakterisierung und Verbesserung der Zusammensetzung und Eigenschaften der für das PV-Vakzin verwendeten Pseudovirionen durchgeführt. Wesentliche Verbesserungen wurden hinsichtlich der Effizienz der PV-Herstellung und bezüglich der PV-Reinheit erzielt. Zahlreiche Immunisierungsexperimente in nicht transgenen Mäusen zeigten, dass die Immunisierung mit Pseudovirionen allein keine starke Immunantwort induziert, und dass eine prime-Immunisierung mit rekombinanten Env-Proteinen notwendig ist, um das Immunsystem effizient auf die geringen Mengen konformationell relevanter Env-Moleküle im PV-Vakzin zu lenken. Neben der Induktion von Env-Antikörpern in den Seren erlaubte das veränderte Protokoll auch die Generierung Env-spezifischer monoklonaler Antikörper (Mabs). Da das PV-Vakzin auch CD4 und CXCR-4 enthielt, wurden weitere Immunisierungen in dagegen toleranten huCD4/huCXCR-4 transgenen Ratten durchgeführt. In einem initialen Immunisierungsexperiment wurden durch das PV-Vakzin neutralisierende Antikörper im Serum induziert und außerdem ein Env-spezifischer monoklonaler Antikörper (R I.23 B/3) generiert, der ein heterologes HIV 1 Primärisolat (J27) neutralisieren kann. Unseres Wissens ist dies der erste nach Vakzinierungen in Versuchstieren hergestellte Mab, der ein heterologes HIV-1 Primärisolat neutralisieren kann. Obwohl die Serumantikörper der vakzinierten Ratte kein Vermögen zur Kreuzneutralisation zeigten, war der Titer gegen homologes Virus höher als in den Seren der Ratten, die mit großen Mengen an rekombinanten Env-Proteinen geboostet wurden. Außerdem zeigte das Tier, welches dieselbe Menge an Env-PV wie im PV-Vakzin erhalten hatte (allerdings ohne ein Mischen mit CD4/CXCR-4-PV), keine neutralisierende Immunantwort. Dies bedeutet möglicherweise, dass konformationelle Epitope des PV-Vakzins für die Induktion der neutralisierenden Immunantwort verantwortlich sind und die geringen Mengen der darin enthaltenen Env-Proteine kompensieren. Diese Immunantworten wecken die Hoffnung, dass Optimierungen des PV-Vakzins, insbesondere die Erhöhung des Env-Einbaus in PV, zur Induktion einer qualitativ besseren Immunantwort führen und somit die Grundlage für weitere Forschungsansätze zur Anwendung im Menschen darstellen könnten.
Die vorliegende Arbeit beschreibt einen neuen Syntheseweg zu bor- und siliziumreichen Verbindungen für einen potentiellen Einsatz als Marker in der energiefilternden Transmissionselektronenmikroskopie und als Therapeutika in der Bor-Neutroneneinfangtherapie. Als Träger der dieser Elemente wurden Furane und Maleinimide gewählt, um sich die Möglichkeit offen zu halten, diese dann über eine Diels-Alder-Reaktion mit entsprechenden Dienen bzw. Dienophilen gezielt weiterfunktionalisieren zu können. Die Basis für borreiche Verbindungen bildete die Gruppe der Carborane. Ausgehend von Hydroxymethyl- und von Acetylfuranen konnten kleine Moleküle gewonnen werden, die bis zu 30 Boratome (je zehn in drei Carboraneinheiten) enthielten. Von diesen Furanen wurden Diels-Alder-Addukte (Modellreaktion mit N-Ethylmaleinimid) dargestellt und charaktersisiert (11 und 18 in Abbildung I). Auch wurde ein Glukokonjugat eines carboranylierten Furans mit zehn Boratomen synthetisiert (56). In Fortführung der Dissertation von Stefan Raddatz [1999] konnten sein Tetracarboranylpropanol (mit 40 Boratomen) entsprechend derivatisiert werden (46). Für die Elementmarkierung in der Elektronenmikroskopie bietet sich neben Bor auch Silizium an. Zu diesem Zwecke wurden einige neue Silsesquioxane dargestellt und analog zum hier beschriebenen Konzept an Furane gekoppelt (63). Alkylbromide der Silsesquioxane (69) sind eine neue Monofunktionalisierung dieser Verbindungsklasse, die weitere Kopplungen ermöglicht. Zur Charakterisierung der dargestellten Substanzen verwendete man die 1H-, 11B-, 13C- und 29Si-Kernresonanzspektroskopie sowie verschiedene massenspektrometrische Untersuchungsverfahren. Zwei der dargestellten Borverbindungen wurden in einem elektronenmikroskopischen Versuch vermessen. Zu diesem Zweck lagerte man die Bor-Verbindungen an bzw. in Kohlenstoff-Nanoröhren ein und untersuchte sie im Elektronenmikroskop. Der Versuchsaufbau erwies sich für diese Verbindungen als wenig geeignet, es konnte kein Bor-Signal detektiert werden. Das Messergebnis schließt jedoch nicht aus, dass die Verbindungen als Elementmarker geeignet sind.
Lokalisierte 1H-MR-Spektroskopie (MRS) ermöglicht die nicht invasive Messung des Metaboliten N-Acetyl-L-Aspartat (NAA) in vivo im Gehirn des Menschen. Da neuronaler Zellverlust einher geht mit einer Abnahme des NAA-Gehalts, könnte der Verlauf von gehirnschädigenden Erkrankungen mit diesem Parameter verfolgt werden. In dieser Arbeit werden neben einem Vorschlag von O. Gonen et al. eigene Ansätze zur Bestimmung des gesamt-Gehalts an NAA im Gehirn (WBNAA) entwickelt und auf 1,5-T-Ganzkörper-MR-Tomographen implementiert. Die Techniken wurden erfolgreich an Phantomen und Probanden getestet. Im Hinblick auf eine klinische Anwendung wurden zudem verschiedene Methoden der absoluten Quantifizierung entwickelt und experimentell überprüft.
Lichtmikroskopische Techniken können benutzt werden, um den Einfluss der räumlichen und zeitlichen Organisation von Chromatin und assoziierten nukleären Faktoren zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit möchte ich mit zwei biologischen Ansätzen die Bedeutung der quantitativen Extraktion von raum- und zeitabhängigen Parametern aus mikroskopischen Bildern untersuchen und deren Auswirkung auf den heutigen Wissensstand über die nukleäre Topologie zeigen. Zusätzlich soll die Software-Plattform Tikal, die ich zur Vereinfachung der quantitativen Analyse multidimensionaler mikroskopischer Bilder entwickelt habe, vorgestellt werden. Im ersten Projekt habe ich die räumliche Position und Verteilung des X-chromosomalen Inaktivierungszentrums (Xic) während der X-chromosomalen Inaktivierung in Zellkernen weiblicher und männlicher embryonaler Mausstammzellen (ES-Zellen) mittels dreidimensionaler (3D) Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), sowie anhand von Lebendzellaufnahmen mittels Lac-Operator markierter Xic-Transgene untersucht. Tikal wurde zur Bildverarbeitung und zur quantitativen Bestimmung der Distanzen zwischen den Xic-Loci in weiblichen ES-Zellen, sowie zur Messung der Abstände der Xic-Signale zur nukleären Peripherie in weiblichen und männlichen ES-Zellen verwendet. In weiblichen ES- Zellen wies eine kleine Population von Zellen eine Kolokalisation der beiden Xic-Loci während der frühen Differenzierungsphase auf. Die funktionelle Bedeutung dieser Annäherung der Xic-Loci während der X-Inaktivierungsphase wird bestärkt durch ihr Fehlen in zwei ES-Zellmutanten, die Defizite in den X-chromosomalen Zähl- und Selektionsmechanismen aufweisen. Ausserdem konnte ich zeigen, dass der Xic-Lokus nahe der nukleären Membran lokalisiert ist. Diese periphere Lage ist am stärksten bei männlichen ES-Zellen während der frühen Differenzierung ausgeprägt. Eine solche räumliche Absonderung des Lokus könnte notwenig sein, um den aktiven Zustand des einzigen X-Chromosoms beizubehalten. Im zweiten Projekt habe ich die Dynamik der nukleären Organisation mit Hilfe von zwei inerten nukleären Körpern, GFP-NLS-vimentin-Partikeln und mikroinjizierten Polystyren-Kügelchen, untersucht. Um die Mobilität der Partikel in sich bewegenden Zellen und in Zellkernen, die ihre Form verändern, quantitativ verfolgen zu können, verwendete ich Tikal. So konnte ich aus Serien mikroskopischer Bilder lebender Zellen die relevanten Parameter mit Hilfe von Tracking Methoden (Verfolgung von einzelnen Objekten in Raum und Zeit) und Bewegungsanalysen extrahieren. Kinetische Analysen zeigten ein Überwiegen nukleärer Partikel mit eingeschränkten Diffusionseigenschaften. Aus den vorliegenden Ergebnissen lässt sich schliessen, dass Chromatindichte und Chromatinumbau auf molekularer Ebene die Beweglichkeit von Proteinbestandteilen innerhalb des Zellkernes direkt beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit möchte ich zunächst die beiden biologischen Fragestellungen erklären und den aktuellen Wissensstand auf dem Gebiet der nukleären Architektur, X-chromosomalen Inaktivierung und Bildverarbeitung kurz darstellen. Anschliessend möchte ich die spezifischen Techniken der Bildverarbeitung, die ich zur Bearbeitung der mikroskopischen Aufnahmen verwendet habe, vorstellen. Zusätzlich sollen das Konzept und die Funktionen meiner Bildverarbeitungs-Software Tikal erläutert werden. Die dann folgenden Kapitel werden sich mit den beiden Projekten über die Analyse der Xic-Lokalisation in ES-Zellen und über die räumliche und zeitliche Verfolgung nukleärer Partikel beschäftigen.
Recently, microarrays of synthetic long sense-oriented oligonucleotides were introduced as an alternative expression profiling platform with distinct advantages to both cDNA arrays and commercial arrays produced by in situ synthesis of multiple short oligonucleotides per gene. However, gene expression analysis using microarrays of long oligonucleotides is limited in that it requires substantial amounts of RNA. The objective of this thesis was to develop protocols that allow for the analysis of gene expression even in minimal samples. Two different approaches were taken, one that amplifies the RNA target material before hybridization and another that amplifies the signal generated on the array. Most existing target amplification protocols linearly amplify mRNA by cDNA synthesis and in vitro transcription. Since orientation of the product is antisense (aRNA), it is inapplicable for dye-labeling by reverse transcription and hybridization to sense-oriented oligonucleotide arrays. Here, a novel protocol (TAcKLE) is introduced in which a combination of two reverse and one forward transcription reactions followed by dye-incorporation using the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I generates fluorescent antisense cDNA. This protocol provides high fidelity and up to 105-fold amplification, starting from 2 ng total RNA. The generated data are highly reproducible and maintain relative gene expression levels between samples. Signal amplification is another option if only minimal amounts of sample material are available. Therefore, a method was evaluated that uses on-chip rolling circle replication of circularized oligonucleotides for the amplified detection of gene expression profiles. This principle should allow for a faster and cheaper experimental procedure, circumventing sequence-dependent amplification bias. The preliminary results provide evidence for the method’s applicability, but further experiments are required to reduce the required amount of starting material and to define a stable protocol. As the TAcKLE protocol performed particularly well, it was subsequently applied to evaluate the utility of spotted oligonucleotide microarrays compared to a widely-used and accepted commercial reference platform. There are numerous ways to perform global transcriptional profiling, among which microarray technology has certainly gained a premier position. The comparison of gene expression measurements obtained with different array-based approaches is therefore of substantial interest in order to clarify whether inter-platform differences may conceal biologically significant information. To address this concern, global gene expression was analyzed in a set of clinical head and neck squamous cell carcinoma samples, using both spotted oligonucleotide microarrays made from a large collection of 70-mer probes and commercial arrays produced by in situ synthesis of sets of multiple 25-mer oligonucleotides per gene. Expression measurements were compared for 4,425 genes represented on both platforms, which revealed strong correlations between the corresponding data sets and similar profiles of relative gene expression. In conclusion, combining the TAcKLE protocol with spotted oligonucleotide arrays is an attractive alternative for transcriptional profiling of limited source material, offering a high potential for gene expression analysis in a multitude of disease situations.
Die Apoptose als programmierter Zelltod spielt eine bedeutende Rolle bei der Ontogenese und Homöostase von mehrzelligen Organismen. CD95 (Fas, APO-1) ist einer von acht bislang identifizierten Rezeptoren, die direkt Apoptose auslösen können und als Todesrezeptoren (engl.: death receptor, DR) bezeichnet werden. CD95-vermittelte Apoptose ist von entscheidender Bedeutung für die Homöostase des Immunsystems. Fehlregulationen im CD95-System tragen außerdem zur Entstehung von Krankheiten wie Autoimmunität, Krebs oder AIDS bei. Bei der initialen Regulation Todesrezeptor-vermittelter Apoptose spielen vor allem Proteine eine Rolle, die sich durch das Vorhandensein von Todeseffektordomänen (DEDs) auszeichnen. Es sind sowohl pro-apoptotische als auch anti-apoptotische DED-enthaltende Proteine bekannt. Zu den pro-apoptotischen DED-enthaltenden Proteinen gehören u.a. Procaspase-8 und -10, während die c-FLIPs (engl.: cellular FLICE inhibitory proteins) zu den wichtigsten anti-apoptotischen DED-enthaltenen Proteinen gehören. Das CD95-vermittelte Todessignal wird nach Aktivierung des Rezeptors durch Anlagerung von cytosolischen Signalmolekülen mit DED-Domänen übertragen. Durch Bindung des CD95-Liganden wird CD95 oligomerisiert, und es bildet sich ein Tod-induzierender Signalkomplex (engl.: death-inducing signaling complex, DISC). In den CD95-DISC werden sowohl die pro-apoptotischen DED-Proteine wie Procaspase-8 als auch die anti-apoptotischen DED-Proteine wie c-FLIPs rekrutiert und abhängig von ihrem Mengenverhältnis zueinander wird der Prozess der Apoptose initiiert oder blockiert. Nicht nur in CD95-vermittelter Apoptose spielen DED-enthaltende Proteine eine Rolle. Es spricht immer mehr dafür, dass DED-Proteine zusätzliche Funktionen bei der Kontrolle zellulärer Aktivierung sowie Proliferation innehaben. Somit charakterisiert die DED-Domäne eine Familie von Proteinen, die wichtig für die Regulation zellulärer Homöostase sind und Proliferation und Apoptose zugleich regulieren können. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das bislang nicht identifizierte DED-enthaltende Protein CAP3 (engl.: cytotoxicity-dependent APO-1 associated protein 3) während der Prozessierung von Procaspase-8 im DISC gebildet wird. Dabei scheint Procaspase-8-Aktivität eine wichtige Rolle zu spielen. Wenn Procaspase-8 zur aktiven Caspase-8 prozessiert wird, findet eine Weiterspaltung von CAP3 in die bekannte Prodomäne von Procaspase-8 statt. Damit wurden neue Erkenntnisse zum entscheidenden Prozess der Aktivierung von Procaspase-8 und damit zu initialen Ereignissen bei der Induktion Todesrezeptor-vermittelter Apoptose gewonnen. Zudem wurde nach weiteren DED-enthaltenden Regulatoren zellulärer Homöostase gesucht und dabei zwei neue c-FLIP-Proteine gefunden: c-FLIPR und p22-FLIP. C-FLIPR wurde als eine neue kurze c-FLIP-Spleißvariante identifiziert, während p22-FLIP ein bisher unbekanntes Spaltprodukt von c-FLIP darstellt. C-FLIPR ist in verschiedenen T- und B-Zelllinien sowie in primären humanen T-Zellen vorhanden. Es enthält ebenso wie die bekannte Spleißvariante c-FLIPS Tandem-DEDs als N-Terminus und einen kurzen C-Terminus. C-FLIPR kann an den CD95-DISC rekrutiert werden und zeigt inhibitorische Funktion bezüglich Todesrezeptor-induzierter Apoptose. Wie c-FLIPS zeichnet es sich durch eine kurze Halbwertszeit und ein ähnliches Expressionsprofil nach Aktivierung und T-Zell-Rezeptor-Restimulation in primären humanen T-Zellen aus. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein weiteres c-FLIP-Protein entdeckt, p22-FLIP. Nach der Identifizierung von p22-FLIP als Spaltprodukt und N-Terminus von c-FLIP-Proteinen wurde p22-FLIP in funktioneller wie mechanistischer Weise charakterisiert. Dabei wurde gezeigt, dass p22-FLIP durch die Aktivität von Procaspase-8 im Cytosol unter nicht-apoptotischen Bedingungen geschnitten wird. Außerdem wurde gezeigt, dass p22-FLIP eine inhibitorische Funktion bei Todesrezeptor-vermittelter Apoptose innehat und gleichzeitig sehr effizient die Aktivität des nukleären Faktors B (NFB) und damit Überlebens-Signalleitung induzieren kann. Damit konnte p22-FLIP als ein wichtiger Parameter für zelluläre Homöostase identifiziert werden, der ähnlich wie virale FLIPs wichtige Prozesse wie Proliferation und Apoptose regulieren kann. Die Fehlregulation von Proliferation und Apoptose ist wahrscheinlich eine entscheidende Voraussetzung für Tumorentstehung und -progression.
Das autonome Parvovirus Minute Virus of Mice MVMp ist ein onkolytisches Virus, da es selektiv neoplastisch transformierte Zellen infiziert und tötet. Während viele zytotoxische Effekte, die eine MVMp Infektion hervorruft, auf Aktivitäten des viralen NS1 Proteins zurückgeführt wurden, sind die Ursachen der MVMp induzierten Wirtszelllyse und ihr Mechanismus bisher unklar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, virale und zelluläre Faktoren der MVMp induzierten Zelllyse zu identifizieren. Es wurde vermutet, dass Phospholipase A2 (PLA2) Enzyme, die in sekretorische sPLA2, zytosolische cPLA2 und Ca2+-unabhängige iPLA2 unterteilt werden, aus den folgenden Gründen für diesen Zusammenhang von Bedeutung sein könnten. Zum einen sind sie als Phospholipidhydrolasen, neben der Produktion von Lipidsignalmediatoren, auch als wichtige Effektoren schwerwiegender Membranveränderungen in der Zelle bekannt. Zum anderen verfügt das parvovirale Kapsidprotein VP1 im N-terminalen Bereich selbst über ein PLA2 Motiv. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigten, dass die N-terminale Domäne von VP1 einen essentiellen Beitrag zur MVMp induzierten Zelllyse leistet. Rekombinante MVMp Viren, die für den N-terminalen VP1 Bereich kodierten, wiesen im Vergleich zu Viren, die ausschließlich die NS Proteine exprimierten, eine stark erhöhte lytische Aktivität auf. Experimente mit rekombinanten Viren, die eine inaktivierende Mutation in der katalytischen Domäne dieses PLA2 Motivs enthielten, ließen jedoch darauf schließen, dass der Beitrag dieses Motivs zur Zelllyse nicht in seiner enzymatischen Aktivität begründet ist. Dieses Ergebnis ließ als Ursache für die beobachtete massive Freisetzung von Arachidonsäure (AA) nach der MVMp Infektion, eine Aktivität zellulärer PLA2 vermuten. AA ist ein gängiges Produkt der PLA2 katalysierten Phospholipidhydrolyse und konnte, korrelierend mit der virusinduzierten Zelllyse, im Kulturüberstand infizierter Zellen detektiert werden. Dass es sich hierbei nicht um einen Nebeneffekt der Zelllyse, sondern einen enzymatisch regulierten Prozess in den noch intakten Zellen handelte, konnte durch den Nachweis einer virusinduzierten, starken Freisetzung von Prostaglandin E2, einem Produkt des AA Metabolismus, bekräftigt werden. In anschließenden Experimenten konnte unter Verwendung etablierter selektiver PLA2 Inhibitoren sowohl die virusinduzierte AA-Freisetzung als auch die Zelllyse gehemmt werden. Die genaue Untersuchung im Hinblick auf die Aktivierung dieser Enyzme ergab, dass cPLA2 infolge der MVMp Infektion an einer für die katalytische Aktivität essentiellen Phosphorylierungsstelle phosphoryliert wird und an intrazellulären Membrankompartimenten akkumuliert. Der Nachweis einer Aktivierung von p38 und p44/42 MAPK, einem der cPLA2 Phosphorylierung vorgeschalteten Ereignis, bestätigte dieses Ergebnis. Während ein Beitrag zellulärer iPLA2 ausgeschlossen wurde, konnte die Bedeutung zellulärer sekretorischer sPLA2 hingegen nicht vollständig klargestellt werden. Basierend auf den hier gezeigten Ergebnissen muss davon ausgegangen werden, dass die MVMp Infektion keine Sekretion des Enzyms hervorruft. Eine intrazelluläre Funktion einzelner sPLA2 Subtypen konnte allerdings nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren geben Untersuchungen mit einem in den NS Proteinen mutierten, hypolytischen MVMp Virus Hinweise darauf, dass auch die viralen NS Proteine eine wichtige Rolle in der MVMp induzierten Zelllyse spielen, da die bei einer wildtyp MVMp Infektion nachgewiesene Stimulation der MAPK und Aktivierung der cPLA2 bei einer Infektion mit diesem Virus ausbleiben. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass cPLA2 Enzyme, als zelluläre Faktoren, und die N-terminale Domäne des VP1 Proteins, als viraler Faktor, erheblich zur Parvovirus MVMp induzierten Zelllyse beitragen.
Die Induktion von Angiogenese und fehlregulierte Signaltransduktionswege, die Proliferation und Überleben von Zellen beeinflussen, sind Kennzeichen von Krebs. Angiogenese wird hauptsächlich durch VEGF aktiviert, dessen Expression unter hypoxischen Bedingungen über den Transkriptionsfaktor HIF induziert wird. JunB-defiziente Mäuse zeigen eine vaskulären Phänotyp und sterben zwischen Tag 8,5 und 10,5 der Embryonalentwicklung. Die auffallenden phänotypischen Übereinstimmungen zwischen JunB-defizienten Embryonen und Mäusen ohne funktionellem VEGF, VEGFR-1, HIF-1a, HIF-2a und ARNT haben uns veranlasst, die molekularen Mechanismen der JunB-Regulation unter hypoxischen Bedingungen zu untersuchen. Expressionsanalysen zeigen, dass unter hypoxischen Bedingungen das junB-Gen selbst induziert wird. Diese Induktion verläuft über NFkB und ist unabhängig von den MAP-Kinasen JNK, ERK und p38 sowie von HIF-1a. Das Fehlen von JunB führt zu einer verminderten basalen Transkription von VEGF und verhindert die Hypoxie-vermittelte VEGF-Induktion fast vollständig, woraus wir schließen, dass JunB ein wichtiger Aktivator der VEGF-Transkription ist. Andererseits wird JunB nicht für die Transkription seines eigenen Gens benötigt, sondern scheint eher seine Transkription unter hypoxischen Bedingungen zu modulieren. Zur Identifizierung neuer JunB-Zielgene, die an der zellulären Hypoxie-Antwort beteiligt sind, wurde eine DNA-Microarray Expressionsanalyse mit heterozygoten und JunB-defizienten Endothelioma-Zellen durchgeführt, die entweder unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden. In einem in vitro Angiogenese-Modell zeigen diese JunB-defizienten Endothelioma-Zellen Defekte in der Röhrenbildung und imitieren den Phänotyp JunB-defizienter Embryonen. Durch die Analyse des DNA-Microarray Experiments konnten 46 Gene identifiziert werden, die unter hypoxischen Bedingungen eine JunB-abhängige Expression aufweisen. Der Transkriptionsfaktor CBFb, der im Verlauf der Arbeit genauer untersucht wurde, wird durch JunB und c-Fos induziert, wie Kotransfektionsanalysen mit einem Reporterkonstrukt zeigen, welches unter der Kontrolle des 1600 bp langen stromaufwärts von CBFb gelegenen Sequenzbereichs steht. RT-PCR- und IHC-Analysen in der Milz und dem Knochenmark von Mäusen mit defizienter oder stark verminderter JunB-Expression belegen, dass die Transkription von CBFb auch in vivo durch JunB reguliert wird. Die transgene Expression von JunB heben den Angiogenesedefekt in junB-/-- Endothelioma-Zellen, der im in vitro Angiogenese-Modell beobachtet wurde, fast vollständig auf. Die JunB-abhängige Transkription von CBFbist demnach ein wichtiger Bestandteil der Gefäßbildung und resultiert, wenn fehlreguliert, zu einer gestörten Angiogenese, wie sie in JunB-defizienten Embryonen beobachtet werden kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen zum ersten Mal die molekularen Mechanismen, die zur Hypoxie-vermittelten Induktion von junB führen. Die Identifikation von CBFbals JunB-Zielgen eröffnen die Möglichkeit, dass die JunB-abhängige CBFbExpression nicht nur in der Angiogenese eine wichtige Rolle spielt, sondern auch bei Knochenerkrankungen und myeloiden Leukämien von entscheidender Bedeutung ist.
MHC-Klasse-I-Moleküle präsentieren gewöhnlich Peptide, die aus zytosolischen Antigenproteinen durch proteasomalen Verdau generiert und anschließend vom TAP-Peptidtransporter ins endoplasmatische Retikulum transportiert werden. Es können jedoch auch endozytierte Antigene für die MHC-Klasse-I-vermittelten Antigenpräsentation prozessiert werden, wobei dieser alternative Weg entweder in einer Proteasom/TAP-abhängigen oder unabhängigen Weise abläuft. Während diese so genannte „Kreuzpräsentation“ für einige exogene lösliche bzw. partikuläre Antigen beschrieben war, war zu Beginn dieser Arbeit die endolysosomale Prozessierung von MHC-Klasse-I-bindenden Peptiden aus zelleigenen, membranständigen Proteinen noch weitgehend unverstanden. In meiner Dissertation habe ich die H-2Kb-vermittelte Antigenpräsentation von Klasse-I-Peptid-Fusionsproteinen als Modellantigensystem verwendet. Ich untersuchte den alternativen, TAP-unabhängigen Prozessierungsweg in immortalisierten Fibroblasten aus TAP-defizienten bzw. Tapasin-defizienten Mäusen sowie mit Hilfe von TAP-defizienten Maus-T-Lymphomzellen. Ich verwendete das aus dem Ovalbumin stammende Kb-bindende Peptid SIINFEKL in kovalenter Verknüpfung mit dem Aminoterminus von Kb- und Kd-Klasse-I-Molekülen, wobei die SIINFEKL-Sequenz am N-terminalen Ende durch verschiedene natürlich vorkommende und artifizielle Sequenzen verlängert wurde. Ich konnte zeigen, dass das SIINFEKL-Epitop aus zahlreichen Sequenzkontexten herausprozessiert und effizient gegenüber SIINFEKL/Kb-spezifischen B3Z T-Hybridomzellen präsentiert wurde. Die Präsentation dieser Peptid-Klasse-I-Konjugate war inhibierbar durch azidophile Amine und Inhibitoren der vakuolären Protonenpumpe, welche den pH von endosomalen Vesikeln anheben. Diese Inhibition weist auf eine Antigenprozessierung im endolysosomalen Weg hin, da sowohl die Funktion von endosomalen Hydrolasen als auch der vesikuläre Transport im endozytischen Weg pH-abhängig sind. Pepstatin A als Inhibitor der endolysosomalen Endoproteasen Cathepsin E und D war ebenfalls in der Lage, die Prozessierung von SIINFEKL-Peptiden aus SIINFEKL-Kd-Konjugaten zu blockieren. Ich konnte jedoch keine Hinweise auf eine Beteiligung der ER-Aminopeptidase ERAP1 bzw. der im trans-Golgi-Netzwerk exprimierten Endoprotease Furin bei der Prozessierung unserer membranassoziierten Modellproteine finden. N-terminale Verlängerungen des SIINFEKL-Epitops und verschiedene C-terminal flankierende Aminosäuren wurden in der Regel effizient entfernt, wobei Prolin als flankierende Aminosäure einschränkend auf die Prozessierung wirkte. Bemerkenswerterweise verwenden nicht nur TAP-defiziente, sondern auch Zellen mit voll funktionsfähigem TAP-abhängigen Peptidbeladungskomplex den alternativen endosomalen Weg der Antigenprozessierung. Dieser neuartige Befund ergab sich durch die gleichfalls in Wildtypzellen vorhandene Blockade der Präsention unserer Fusionsproteine durch Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung. Darüberhinaus untersuchte ich den Mechanismus der Internalisierung der Peptid-Klasse-I-Konjugate von der Zelloberfläche. Inhibitorstudien zeigten, dass sowohl die Clathrin-abhängige wie die Clathrin-unabhängige Endozytose bei der Internalisierung der Konjugate beteiligt war. Interessanterweise spielten Sortierungssignale in der zytoplasmatischen Domäne von Klasse-I-Molekülen keine Rolle für das Erreichen von prozessierungsaktiven Kompartimenten, da diese Domäne ohne Verlust der Antigenpräsentation deletiert werden konnten. Die Rezyklierung von peptidbeladenen Kb-Molekülen aus Endosomen zur Zelloberfläche zeigte sich ebenfalls unbeeinflusst durch Signale in der zytoplasmatischen Domäne. SIINFEKL-beladene Kb-Moleküle konnten durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie in frühen und späten Endosomen nachgewiesen werden. Diese Arbeit belegt die funktionelle Relevanz eines bislang noch wenig untersuchten, alternativen Antigenpräsentationswegs, der nach Internalisierung und endosomaler Prozessierung von internalisierten, endogen synthetisierten Transmembranproteinen zur Präsentation von Antigenpeptiden auf rezyklierenden MHC-Klasse-I-Molekülen führt.
Gehirntumoren, allen voran Gliome, stellen eine heterogene Zellpopulation aus transformierten Zellen und einwandernden Leukozyten dar. Bis zu 45% der Tumormasse sind Makrophagen und Mikroglia, die auch als Makrophagen des Gehirns bezeichnet werden. Die Funktion dieser Fresszellen innerhalb des Tumors ist noch weitestgehend unklar und wird als wachstumsfördernd, aber auch tumorbekämpfend angesehen. Die vorliegende Arbeit sollte zur Klärung dieser Frage beitragen. Es sollte untersucht werden, ob murine, primäre Mikroglia in vitro in der Lage sind, nach Aktivierung toxisch auf Gehirntumorzellen zu wirken. Es zeigte sich, dass Mikroglia nach Priming mit IFN-g und Aktivierung mit LPS toxische Komponenten sezernieren, die in drei verschiedenen Gliomzelllinien Apoptose hervorrufen. Die untersuchten Zellen starben - abhängig von der Zelllinie - einen bis vier Tage nach der Behandlung. Der Zelltod wurde weder durch Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-a noch durch Stickstoffmonoxid (NO) ausgelöst; eine Beteiligung von Interferon (IFN)-b konnte nicht eindeutig ausgeschlossen werden. Inwieweit solche toxischen Effekte jedoch in vivo ausgeübt werden können, ist unklar. Durch vom Tumor sezernierte, immunsupprimierende Substanzen wird die Immunkompetenz der Mikroglia wahrscheinlich unterdrückt. Daher müssen Wege gefunden werden, diese potenziell toxischen Zellen in situ zu aktivieren. Eine Möglichkeit bietet der Einsatz onkotroper parvoviraler Vektoren, die über ein bis mehrere Transgene eine Aktivierung des Immunsystems einleiten könnten. Als Vorarbeit dazu wurde im Rahmen dieser Arbeit die Infektion von murinen, primären Gliazellen mit dem murinen Parvovirus MVM untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl Astrozyten als auch Mikroglia in der Lage sind, das Virus zu internalisieren. Replikation der viralen DNA und Expression von viralen Proteinen findet in nur 5-10% der Astrozyten, nicht aber in Mikroglia statt. MVM hat keinen Einfluss auf die Aktivierung beider Zelltypen mit LPS und IFN-g; die Zytotoxizität der Mikroglia gegen Hirntumorzellen wird weder positiv noch negativ beeinflusst. Die vorliegende Arbeit bietet eine Grundlage für eine mögliche Gentherapie von Gehirntumoren. Mikroglia könnten innerhalb der Tumormasse aktiviert werden und so Apoptose der transformierten Zellen auslösen. Die Aktivierung der Zellen könnte mit Hilfe parvoviraler Vektoren gezielt unterstützt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Prototyp eines Nadelhalters für perkutane Interventionen an MR-Tomographen entwickelt. Mittels kleiner, am Nadelhalter angebrachter aktiver Markerspulen ist dieser durch Projektionstechniken lokalisierbar und es ist möglich, die Schichtorientierung für die Bildgebung automatisch einer bewegten Nadel nachzuführen. Zur Darstellung der Nadel, die nur indirekt durch ihr Artefakt sichtbar ist, wurden schnelle MR-Pulssequenzen (trueFISP, HASTE) implementiert, die den Eingriff in nahezu Echtzeit darstellen können und die Artefaktgröße im Vergleich zu konventionellen Gradientenecho-Sequenzen verkleinern. Zur Nadelverfolgung wurde eine neuartige targeted-HASTE-Sequenz (TASTE) entwickelt, die es ohne Einfaltungsartefakte ermöglicht, einen schmalen Streifen um die Nadel abzubilden. Im Vergleich zu konventionellen HASTE-Sequenzen konnte dadurch sowohl die räumliche Auflösung als auch die Bildwiederholrate gesteigert werden. Im Tierversuch wurde die TASTE-Bildgebung in Kombination mit einer robotischen Positionierungshilfe und automatischer Schichtnachführung evaluiert. Nach vorheriger Interventionsplanung konnten mehrere Nadelvorschübe mit Hilfe der Echtzeitbildgebung erfolgreich durchgeführt werden. Ein weiterer Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Lokalisation von induktiv gekoppelten passiven Markerspulen. Mit einer passiven Spule, die auf die Thoraxwand von Probanden angebracht wurde, konnte die Atembewegung direkt gemessen und zur retrospektiven Bewegungskorrektur von Spinecho-Bildern genutzt werden. Mit einer schnellen Positionsbestimmung der Spule konnte in Verbindung mit abdomineller trueFISP-Bildgebung die äußere Atembewegung mit der inneren Organbewegung korreliert werden. Im Rahmen einer klinischen Studie wurde diese Methode genutzt, um die Bewegung von inneren Organen bei verschiedenartigen Atemmanövern zu untersuchen. Diese Methode soll die Grundlage darstellen für ein verbessertes Behandlungskonzept der Strahlentherapie bewegter Tumore.
Arraytechnologien gewinnen zunehmend an Bedeutung in der aktuellen biologischen, medizinischen und pharmazeutischen Forschung. Das Peptidchip -Gemeinschaftsprojekt zwischen dem Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) und dem Kirchhoff-Institut für Physik der Universität Heidelberg (KIP) hat zum Ziel, Arrays hoher Dichte zu entwickeln, die insbesondere für kombinatorische Peptidsynthese und die zugehörigen Bindungsexperimente geeignet sind. Im Rahmen dieses Projekts durchgeführt, beschreibt diese Arbeit die Entwicklung eines ASICs in Hochspannungs-CMOS-Technologie, der als Träger für ein solches Peptid-Microarray nutzbar ist. Geladene Partikel, die Aminosäuren oder andere Monomere enthalten können, werden im vom Chip erzeugten elektrischen Feld ortsselektiv auf der modifizierten Oberfläche des Chips abgelagert. Dies erlaubt die parallele Synthese mehrerer Oligomere auf dem Chip. Strukturen mit Spotabständen zwischen 100µm und 45µm und schaltbare Potentiale von bis zu 100V wurden implementiert und getestet. Ein I2C-Interface wird benutzt, um den Chip mit Partikelablagerungsmustern zu programmieren. Der Chip ermöglicht auch die Untersuchung optischer Methoden zur Detektion von Bindungsereignissen unter Verwendung von integrierten CMOS-Photodioden. Architektur, Design und Simulation des Chips werden in dieser Arbeit beschrieben, ebenso wie experimentelle Ergebnisse des ortsselektiven Transfers von Partikeln auf den Chip.
Für die autonomen Parvoviren MVMp und H-1 Virus wurden onkotrope und onkolytische Eigenschaften beschrieben, also eine präferentielle Replikation dieser Viren mit einhergehender Lyse in transformierten Zellen. Eine Transformation von Zellen mit Onkoproteinen wie aktiviertem Ras Protein führt zu einer Steigerung der Expression vom frühen P4 Promotor und zu einer verstärkten Toxizität des Nichtstrukturproteins NS1. Die Verwendung der P4-ns1-P38 Kassette aus H-1 Virus in einem AAV-2 Vektor sollte diesem Hybridvektor TRH1 neue Eigenschaften verleihen. Die Eigenschaften des Hybridvektors TRH1 wurden einerseits hinsichtlich der Transduktion charakterisiert, andererseits bezüglich einer selektiven Expression in transformierten Zellen. Der Hybridvektor TRH1-GFP zeigte in HeLa Zellen eine erhöhte Basistransduktion gegenüber herkömmlichen AAV-2 Vektoren, vermutlich aufgrund einer stärkeren Expression. Eine Transduktion mit AAV-2 Vektoren kann durch verschiedene Behandlungen der Zellen oder Koinfektion mit Adenovirus 5 stimuliert werden. Eine Transduktion mit TRH1-GFP kann neben einer Koinfektion mit Adenovirus 5 durch UV- und Gamma-Bestrahlung und einer Behandlung der Zellen mit Chemotherapeutika wie Cisplatin, Mitomycin und Carmustine (BCNU) gesteigert werden. Somit verhält sich der Hybridvektor TRH1-GFP wie ein reiner AAV-2 Vektor. Eine Stimulierung der Transduktion mit AAV-2 Vektoren durch Chemotherapeutika oder Gamma-Bestrahlung bietet die Möglichkeit einer Kombinationstherapie. Die hier beschriebene Möglichkeit einer Stimulierung durch BCNU erweitert das Spektrum kombinierbarer Medikamente mit einer AAV Vektor vermittelten Gentherapie. In einem Vergleich der Infizierbarkeit verschiedener Tumorzellinien mit dem Hybridvektor TRH1-GFP gegenüber einem rekombinanten H-1 Vektor, rH1-GFP, konnten die Tumorzellinien erwartungsgemäß mit unterschiedlicher Effizienz transduziert werden. Die Verwendung des Hybridvektors TRH1-GFP in einem AAV-2 Kapsid vermittelt also ein anderes Spektrum infizierbarer Zellen gegenüber einem rekombinanten H-1 Vektor und erweitert so den Einsatzbereich für die Verwendung der P4-ns1-P38 Kassette. In vitro konnte für die Hybridvektoren TRH1-GFP und TRH1-TK, aber auch für herkömmliche AAV-2 Vektoren, eine selektive Expression in transformierten Zellen unter Verwendung von Zellpaaren gezeigt werden. In einem in vivo Tumormodell wurde die Expression verschiedener parvoviraler Vektoren untersucht. Es wurde ein Vektor verwendet, der sich von H-1 Virus ableitete (rH1-hRluc), ein herkömmlicher AAV-2 Vektor (CMV-hRluc) und der Hybridvektor TRH1-hRluc. Die Expression der verschiedenen Vektoren im Leberzellkarzinom (MH3924A) wurde mit der im Leberparenchym verglichen. Alle verwendeten parvoviralen Vektoren zeigten eine stimulierte Expression im Tumorgewebe gegenüber der im Leberparenchym. Jedoch erhöhte die Verwendung der P4-ns1-P38 Kassette im Hybridvektor TRH1-hRluc verglichen mit CMV-hRluc in diesem Tumormodell nicht die Selektivität der Expression im Leberzellkarzinom gegenüber der im Leberparenchym. Die Expression von Vektoren der autonom replizierenden Parvoviren in normalen gegenüber transformierten Zellen wurde bisher nur in vitro, jedoch nicht in vivo untersucht. Der in diesem in vivo Tumormodell ermittelte Faktor einer Stimulierung der Expression des Hybridvektors TRH1-hRluc im Leberzellkarzinom war vergleichbar mit dem Faktor bei der Verwendung des Vektors rH1-hRluc.
Die modernen Verfahren in der heutigen Strahlentherapie wurden dazu entwickelt, das Bestrahlungsfeld optimal auf den Tumor zu konzentrieren und dabei die applizierte Dosis im umgebenden gesunden Gewebe zu minimieren. Organbewegungen und Lagerungsfehler verhindern jedoch, dass mit diesen Techniken eine Präzision im Millimeterbereich erreicht werden kann. Daher setzt sich diese Arbeit zum Ziel, den Einfluss solcher Veränderung auf die Strahlentherapie zu analysieren und Strategien vorzustellen, die eine bessere Konformität der Bestrahlung gewährleisten. Für die interfraktionellen Variationen, also solche, die von einer Fraktion zu nächsten auftreten, wurden mit Hilfe von vier Patientendatensätzen aus mehreren CT-Aufnahmen Strategien zur täglichen Neuplanung, Lagerungskorrektur bzw. Korrektur eines systematischen Lagerungsfehlers untersucht, wobei eine signifikante Verbesserung der Dosisverteilung erreicht werden konnte. Die intrafraktionellen Variationen, wie z.B. atmungsbedingte Organbewegungen, wurden mit Hilfe eines bewegten Lungenphantoms analysiert. Hier müssen verschiedene Aspekte der Bildgebung und Bestrahlung zu einer vierdimensionalen Behandlungsstrategie vereint werden. Alle dafür benötigten Schritte wurden im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Hierzu zählt im letzten Schritt auch eine atemgesteuerte Bestrahlungstechnik, mit der es möglich war, für Messungen mit dem dynamischen Lungenphantom eine mittlere Dosissteigerung im Zielvolumen von 90% auf etwa 99% der verschriebenen Dosis zu erreichen.
Die Therapie mit hochenergetischen fokussierten Ultraschallwellen (HIFU, high intensity focused ultrasound) ist eine minimal invasive Methode, Tumorgewebe lokal thermisch zu zerstören. Als Ultraschallquellen werden meist hoch fokussierende Ultraschallwandler verwendet, die nur geringe Ablationsraten zulassen, was bei großen Tumoren zu langen Behandlungszeiten führen kann. Gegenstand dieser Arbeit war es, Möglichkeiten zur Reduktion der Therapiezeit zu untersuchen. Zunächst wurden mittels mathematischer Simulationen Ultraschall-Vorsatzlinsen zur Modifikation eines gegebenen fokussierten Schallfeldes entwickelt. Die zwei besten Linsen wurden aus Polystyrol angefertigt und experimentell untersucht. Hierzu diente ein neues, im Rahmen dieser Arbeit entwickeltes, gewebeähnliches Ultraschallphantom aus einer mit Hühnereiweiß dotierten Polyacrylamidmatrix. In einem weiteren Schritt wurde für eine gegebene klinische HIFU-Therapieeinheit mittels Simulationsrechungen ein optimierter Phased Array Ultraschallwandler konstruiert. Sowohl in den Simulationen als auch experimentell konnte gezeigt werden, dass mit den entwickelten Ultraschalllinsen die Ablationszeiten bis auf ein Fünftel reduziert werden können. Das entwickelte Ultraschallphantom ist transparent und zeigt bei Temperaturen über 67°C sichtbare weiße Koagulationen. Die theoretischen Untersuchungen zum Aufbau eines Phased Array Ultraschallwandlers (Durchmesser 100 mm, Brennweite 88 mm) haben gezeigt, dass eine randomisierte Elementanordnung von 217 Einzelelementen mit einem Elementdurchmesser von 4,5 mm bei einer Frequenz von 1,5 MHz für die Therapie von Mammatumoren in der vorgegebenen Therapieeinheit optimal sind. Die in dieser Arbeit entwickelten Ultraschalllinsen werden zukünftig zur Beschleunigung der HIFU-Therapie von Tumoren der Mamma klinisch eingesetzt. Mit dem transparenten Ultraschallphantom ist ein standardisiertes Hilfsmittel geschaffen worden, das den Vergleich von Simulation und Experiment deutlich vereinfacht. Eine Realisierung des konstruierten Phased Array Wandlers würde die HIFU-Therapieeinheit noch weiter flexibilisieren.
In dieser Arbeit sollte das Potential synthetischer Saccharidmimetika getestet werden, verschiedene Schritte der metastatischen Kaskade in vitro zu hemmen. Dabei wurden an Melanomzellen einige ausgewählte Strukturen zweier Substanzbibliotheken auf ihre Wirkung gegenüber der Zell-Adhäsion und -Migration sowie der Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen untersucht. Erste Versuche mit galactosylierten Cyclohexan-Derivaten haben gezeigt, daß sich die Adhäsion von B16F10-Mausmelanom-Zellen an Fibronectin in Anwesenheit von 40 mM 1,3-Bis-beta-D-galactopyranosyl-oxymethyl-5-hydroxymethyl-cyclohexan um 80 % inhibieren läßt. Die Wirksamkeit von Galactose als aktives Element bestätigten Adhäsionsversuche mit digalactosylierten Furan-Derivaten, welche in äquivalenter Konzentration in der Lage waren die Adhäsion der B16F10-Zellen an Fibronectin (40 %), Vitronectin (50 %) und Laminin (50 %) signifikant zu reduzieren. Der Furanring als Grundgerüst der Saccharidbibliothek bietet dabei den Vorteil, daß das Saccharidmimetikum über eine Diels-Alder-Reaktion an Fluoreszenz-Farbstoffe gekoppelt werden kann. Auf diese Weise lassen sich Moleküle erzeugen, die als Marker zuckerbindender Strukturen zur Aufklärung des Wirkmechanismus der Saccharidmimetika genutzt werden können. Die Substitution eines Galactoserestes am Furan-Ring gegen eine Fucoseeinheit ergab keine Verbesserung der inhibitorischen Eigenschaften. Auch eine Übertragung der Ergebnisse auf die humane Melanom-Zellinie WM-115 ergab für 40 mM 3,4-Bis-beta-D-galactopyranosyl-oxymethyl-furan nur noch einen geringen Rückgang der Adhäsion an Fibronectin (26 %) bzw. Fibrinogen (30 % ab 5mM). Ein Effekt der Substanz auf die Aktivität der Matrix-Metalloproteinase-2 bzw. das Migrationspotential der Zellen war nicht zu erkennen. Die Addition einer geladenen Sulfatgruppe an den Furanring ergab schließlich die gewünschte Optimierung der Wirksamkeit des Saccharidmimetikums. 3-beta-D-Galactopyranosyl-oxymethyl-4-sulfatomethyl-furan (GSF) ist in der Lage die Adhäsion des B16F10 Maus-Melanoms und der humanen WM-115-Linie an Fibronectin (40 mM) und Fibrinogen (20 bzw. 10 mM) vollständig zu unterdrücken. Es verminderte die Aktivierung der MMP-2 und inhibierte die Migration von Zellen in einer Konzentration von 5 mM. Ein Rückgang der Zellzahl um 50 % aufgrund cytotoxischer Effekte ist bei dieser Konzentration erst nach mehr als 60 h erkennbar und daher für die beschriebenen Versuche nicht relevant. Die vollständige Inhibition der Adhäsion, sowie die signifikanten Auswirkungen auf die Aktivierung von MMP-2 und die Zell-Migration deuten auf eine Interaktion von GSF mit einem oder mehreren Mitgliedern der Integrinfamilie hin. Anhand der vorliegenden Arbeit ist es gelungen zu zeigen, daß insbesondere geladene Saccharidmimetika das Potential besitzen die metastasierenden Eigenschaften von Melanomzellen in vitro zu unterdrücken. Das Screening nach weiteren geladenen Saccharidmimetika auf Furanbasis, deren vergleichbare Wirkung in geringeren Konzentrationen vorhanden sein sollte, scheint erfolgsversprechend und die Substanzen sollten durch die Möglichkeit einer kombinatorischen Synthese zugänglich sein.
Mehr als 100 humane Papillomvirus (HPV)-Typen können den Menschen infizieren und teilweise maligne Erkrankungen auslösen. HPV-Seroepidemiologie erlaubt es, die Infektion und Krankheits-Assoziation von HPV zu untersuchen und Krebs-spezifische Antikörpermuster zu detektieren, wird jedoch durch die Vielfalt der Virustypen und -proteine und die Typspezifität der gegen sie gerichteten Antikörper erschwert. Der bisher zur Detektion von Antikörpern genutzte GST capture ELISA ist methodisch ausgereift und gut validiert, im Hinblick auf die Zahl parallel analysierbarer Antigene jedoch beschränkt. Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung eines Antikörperscreeningsystems, das eine Hochdurchsatzanalyse von Seren auf Antikörper gegen viele in situ-affinitätsgereinigte Antigene in einem Reaktionsansatz erlaubt. Zwei solche Systeme wurden entwickelt: Ein auf Protein Microarray-Technologie basiertes System (Chip-ISA), für das sich die in situ-Affinitätsreinigung der Antigene nicht realisieren ließ, und ein System namens Multiplex-Serologie, das auf einem Suspensions-Array von farbkodierten Polystyrolbeads beruht, die sich in einem Duchflusszytometer unterscheiden lassen. Nach Etablierung einer Methodik zur Derivatisierung dieser Beads mit Glutathion konnten die als GST-Fusionsproteine exprimierten Antigene direkt aus Bakterienlysat aufgereinigt werden. Multiplex-Serologie wurde vollständig validiert und ist gut reproduzierbar, sehr sensitiv und spezifisch. Die Methode wurde zur Analyse großer Serumzahlen adaptiert und erlaubt jetzt die Untersuchung von bis zu 1000 Seren auf Antikörper gegen bis zu 100 simultan getestete Antigene pro Tag. Über die technische Entwicklung hinaus wurden mit Multiplex-Serologie verschiedene seroepidemiologische Studien analysiert und die Ergebnisse von dreien im Detail vorgestellt. Erstmals wurde die Seroprävalenz gegen die L1-Proteine von 13 HPV-Typen in der deutschen Normalbevölkerung untersucht und auf Alters- und geschlechtsabhängige Dynamik analysiert. In einer zweiten Studie wurde die Assoziation von Antikörpern gegen die L1-Proteine einiger sogenannter EV-HPV-Typen mit nicht melanotischem Hautkrebs untermauert. Ebenfalls zum ersten mal wurde gezeigt, dass typspezifische Antikörper gegen die E6- und E7-Proteine seltener sogenannter Hoch-Risiko-HPV-Typen existieren und mit Zervix-Karzinomen assoziiert sind. Die Entwicklung von Multiplex-Serologie erlaubt erstmals die simultane Analyse von komplexen Antikörperantworten gegen bis zu 100 Proteine und stellt möglicherweise einen Quantensprung für (HPV-)Seroepidemiologie dar.