German Title: Untersuchungen altersbedingter Veränderungen auf Protein- und Lipidebene mittels STED-Mikroskopie

Preview

PDF, English Download (82MB) | Terms of use

Abstract

High resolution light microscopy is gaining in importance in the Life Sciences. This thesis reports on two applications of the STED (stimulated emission depletion) principle investigating alterations on the protein and lipid level occurring during aging. One hallmark of age-related neurodegenerative diseases is the abnormal post-translationally occurring hyperphosphorylation of proteins. Here, the interplay of two main post-translational modifications of neurofilaments, phosphorylation and glycosylation, was investigated. The organization pattern of these modifications can not be resolved by conventional diffraction-limited light microscopy. However, with the about 10-times higher resolution of STED microscopy the organization for both modifications was revealed. Long term glucose deprivation of redifferentiated neuroblastomas results in axonal swellings and cell death, which could not be rescued by refeeding glucose. These severe alterations could be observed by confocal resolution (~250 nm). Taking advantage of the higher resolution of the STED microscope (20-30 nm) allowed the detection of earlier alterations in the pattern of both modifications, where cell death could be prevented by the refeeding of glucose. Two kinases were found to be involved in the phosphorylation events occurring upon glucose deprivation in redifferentiated SH-SY5Y: the mitogen activated protein kinase p38 MAPK and to a lower extent also the stress activated protein kinase JNK. An effect occurring during aging is the change in the plasma membrane's fluidity. This thesis reports on the investigation of the diffusion characteristics of different phospholipids in dependency of the endogenous cholesterol content on a nanoscale. Fluorescent mono- and diacyl-phospholipid analogs were incorporated via BSA-complex formation into the plasma membrane of living cells. It was found that for best incorporation a molar ratio of 1:1 (fatty acid chains:BSA molecules) had to be used. Analogs of the phosphoglycerolipids and the sphingolipids, respectively, were the central study in this thesis. It was shown that sphingolipids, in contrast to phosphoglycerolipids, were trapped on spatial scales below 30 nm, which could not be examined by confocal microscopy. Upon changing the endogenous cholesterol level, enzymatically with cholesterol oxidase and by host-guest complex formation using the oligosaccharide β-cyclodextrin, respectively, this hindered-diffusion could be reversibly abolished.

Translation of abstract (German)

Hochauflösende Mikroskopieverfahren gewinnen zunehmend an Bedeutung in den Lebenswissenschaften. In dieser Arbeit werden zwei Anwendungen des STED (Stimulated Emission Depletion) Prinzips vorgestellt, die sich mit der Untersuchung von altersbedingten Veränderungen auf der Protein- und Lipidebene befassen. Ein Kennzeichen altersbedingter neurodegenerativer Erkrankungen ist eine abnorme post-translationelle Hyperphosphorylierung von Proteinen. In dieser Arbeit wurde das Wechselspiel zwischen den zwei häufigsten post-translationellen Modifizierungen von Neurofilamenten, Phosphorylierung und Glykosylierung, untersucht. Die Art der Organisation dieser Modifizierungen kann nicht mit herkömmlichen beugungsbegrenzten Mikroskopieverfahren aufgelöst werden. Die allerdings 10-fach höhere Auflösung der STED-Mikroskopie ermöglichte die Darstellung beider Modifizierungen. Langanhaltender Glukosemangel bei redifferenzierten Neuroblastoma führte zu axonalen Schwellungen und schliesslich zum Zelltod, der durch die Zugabe von Glukose nicht verhindert werden konnte. Diese schwerwiegenden Veränderungen konnten bereits mit konfokaler Auflösung (~250 nm) beobachtet werden. Unter Ausnutzung der höheren Auflösung der STED-Mikroskopie (20-30 nm), konnten Veränderungen in dem Muster beider Modifizierungen schon zu einem früheren Zeitpunkt festgestellt werden. Zu diesem Zeitpunkt konnte die Zugabe von Glukose den Zelltod noch aufhalten. Zwei Kinasen zeigten einen Aktivitätsanstieg ausgelöst durch Glukosemangel in redifferenzierten SH-SY5Y: die Mitogen aktivierte Proteinkinase p38 MAPK und in geringerem Ausmaß die Stress aktivierte Proteinkinase JNK. Ein weiterer Effekt, der altersbedingt auftritt, ist die Veränderung in der Fluidität der Plasmamembran. In dieser Arbeit wurden die Diffusionseigenschaften verschiedener Phospholipide in Abhängigkeit des endogenen Cholesterolspiegels auf kleinster Skala untersucht. Fluoreszierende Mono- und Diacylphospholipidanaloga wurden durch BSA-Komplexbildung in die Plasmamembran lebender Zellen eingegliedert. Für eine gute Eingliederung musste ein molares Verhältnis von 1:1 zwischen den Fettsäureketten und den BSA Molekülen herrschen. Phosphoglycerolipid- und Sphingolipidanaloga standen im Mittelpunkt der Untersuchungen. Es konnte gezeigt werden, dass Sphingolipide im Gegensatz zu den Phosphoglycerolipiden auf Skalen kleiner 30 nm gehinderte Diffusion (trapping) aufwiesen. Dies konnte nicht mit konfokaler Mikroskopie beobachted werden. Nach Veränderung des endogenen Cholesterolspiegels, entweder enzymatisch durch Cholesterol-Oxidase oder durch Wirt-Gast Wechselwirkungen von β-Cyclodextrin mit Cholesterol, konnte diese gehinderte Diffusion aufgehoben werden.