German Title: Transkriptom Analysen im Gehirn auf Zelltyp Ebene : Analyse der Neuron-Glia Interaktion in Plp1 und Cnp1 defizienten Maeusen

Preview

PDF, English Download (16MB) | Terms of use

Abstract

Global gene expression profiling is a powerful tool to obtain deep insights into physiological and pathological cellular mechanisms. The enormous cellular complexity of the mammalian brain, however, is a major obstacle for gene expression profiling. Physiologically relevant changes of transcription that occur in specific cell populations are likely to remain undetected in cellularly complex samples. The purification of single populations of neural cell types eliminates these difficulties. We have approached this problem in transgenic mice by labelling genetically-defined neural cell types that express variants of GFP. When combined with isolation techniques such as fluorescence activated cell sorting (FACS) or laser capture microdissection (LCM), the isolation of intact RNA from unfixed cells for global transcriptome analysis is possible. In this study we applied FACS and LCM to isolate neurons and glia to gain insight into cell type specific gene expression. We profiled glial precursor cells, microglia and oligodendrocytes using FACS and generated a transcriptome database for glial cell types. LCM was used to study single isolated callosal projection neurons from the cortex of mouse models, which develop adult onset axonal degeneration a hallmark of many neurodegenerative diseases such as parkinson disease, Alzheimer disease and Multiple Sclerosis (MS). The identification of molecular mechanisms underlying axonal degeneration is critical to design rational therapies for neurodegenerative diseases. Therefore we profiled wild type controls, Cnp1 and Plp1 null mutant mice (myelin specific genes) at 4 different time points during adulthood. Cnp1 and Plp1 null mutants show axonal swellings and with age severe neurodegeneration, although CNS myelin seems ultra structural not affected. In summary, we have shown the feasibility to "snapshot" gene expression profiles of genetically defined neuronal subtypes in vivo and to compare morphologically similar neurons at a given time in pathological conditions. We followed gene expression changes starting from early disease states until stages of severe pathological signs, focusing on cells known to be susceptible to a genetic predisposition. Our analysis revealed several known and novel candidate genes and mechanisms that likely play a role in the early adaptive responses of cortical projection neurons to cope with axonal stress.

Translation of abstract (German)

Die Erstellung von Genexpressions-Profilen erlaubt profunde Einblicke in zellulärer Mechanismen unter physiologischen als auch pathologischen Bedingungen. Die Anwendung dieser Methode auf neurales Gewebe ist durch die enorme zelluläre Komplexität des Gehirns stark limitiert. Physiologisch relevante Veränderungen der Transkription in spezifischen Zellpopulationen können in komplexen Zellverbänden nicht detektiert werden. Daher ist die Aufreinigung einzelner Zelltypen aus Gewebsproben des zentralen Nervensystems (ZNS) somit ein hilfreicher Ansatz bei der Untersuchung des Expressionsprofils einzelner Zelltypen. Für die Umsetzung wurden in dieser Arbeit genetisch modifizierte Mausmodelle verwendet, die zelltyp-spezifisch Varianten des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) exprimieren. Kombiniert mit speziellen Isolationstechniken, wie fluorescence activated cell sorting (FACS) oder laser capture microdissection (LCM), ist die Gewinnung intakter RNA aus unfixierten Zellen für die globale Transkriptionsanalyse einzelner Zelltypen möglich. In dieser Studie wurden FACS und LCM zur Isolation von definierte Neuronen und Gliazellen eingesetzt, um daraufhin Erkenntnisse über zelltyp-spezifische Genexpression zu gewinnen. Mittels FACS wurden Expressionsprofile von glialen Vorläuferzellen, Mikroglia und Oligodendrozyten erstellt und eine Transkriptom-Datenbank für gliale Zelltypen generiert. Ferner wurde mittels LCM das Expressionsprofil einzelner Projektionsneurone aus dem Kortex von Cnp1 und Plp1 mutanten Mäusen von frühen Krankheits- bis hin zu massiven pathologischen Stadien untersucht. Diese Mausmutanten entwickeln im adulten Tier axonale Degenerationen, wie sie in vielen neuro-degenerativen Erkrankungen, zum Beispiel Parkinson, Alzheimer oder Multipler Sklerose, beschrieben werden. Die Identifikation der molekularen Mechanismen, die mit diesen axonalen Degenerationen einhergehen, ist notwendig für die Entwicklung therapeutischer Ansätze. Für die Charakterisierung der Expressionsprofile der degenerierenden Projektionsneurone in diesen Mausmutanten, wurden zu vier Zeitpunkten während des adultem Stadiums Gewebsproben isoliert und analysiert. Mit Hilfe dieser konnte eine „Momentaufnahme“ der Expressionsprofile von definierten neuronalen Subpopulation in vivo gemessen werden. Diese Studie liefert Auskunft über bekannte wie auch neue Kandidantengene und potentielle Mechanismen, die womöglich eine wichtige Rolle in der Verarbeitung und Kompensation von pathologischen Vorgängen neuro-degenerativer Erkrankungen spielen.