German Title: Identifizierung neuer Regulatoren des TNF-alpha Signalweges mittels genome-weiter RNAi Screens

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Abstract

Signaling pathways are crucial for multicellular organisms: they are necessary for cell communication and development, they enable cells to specialize and act together. TNF-alpha signaling is one such pathway crucial for orchestrating the body's response to cellular stress or invasion by pathogens. TNF- signaling mediates inflammation, a key event for an efficient innate immune response. As inflammation has to be tightly controlled in order to avoid damage to the host, deregulation of TNF-alpha signaling has been implicated in the pathogenesis of many inflammatory diseases and cancer. TNF-alpha exerts inflammatory effects by binding to its receptor, TNFR1. Upon binding, several proteins including DD (death domain) proteins are recruited to TNFR1 to form the TNFR complex, resulting in the activation of the IkappaB kinase complex (IKK). Subsequently, inhibitor of kappaB (IkappaB) proteins are phosphorylated and degraded, releasing transcription factors of the NF-kappaB family. NF-kappaB then controls the expression of hundreds of different genes required for inflammation and innate immunity. The aim of my PhD project was to identify new factors required for TNF-alpha signaling. In order to monitor NF-kappaB transcriptional activity upon stimulation with TNF-alpha, I established a cell-based dual luciferase assay. This assay was suited to measure TNF-alpha signaling activity in miniaturized format necessary for large-scale experiments. For finding novel regulators of TNF-alpha signaling, I used the cell-based dual luciferase assay in two genome-wide RNAi screens. These screens identified several candidates potentially implicated in NF-kappaB activation by TNF-alpha. I next established secondary assays for confirming the requirement of these candidates in TNF-signaling. On the basis of the results of these secondary assays, I selected three candidates, SPP1, GAB3 and CASP4, for further characterization. Epistasis experiments revealed that SPP1, GAB3 and CASP4 are required for the activation of the IkappaB kinase complex. Further experiments demonstrated that the candidates are not essential for proper TNFR1 cell surface expression. SPP1, a multifunctional protein, has been described to interact with the DD protein MyD88 during Toll-like receptor signaling. It could thus interact with DD proteins present in the TNFR complex. GAB3 belongs to a family of scaffold proteins of which one member, GAB2, has been shown to interact with RANK, a TNFR family member. Analogously, GAB3 could act as a scaffold at TNFR1 supporting the recruitment of signaling molecules. CASP4 is an inflammatory caspase. My results indicate that CASP4 catalytical activity is dispensable for its role in TNF-alpha signaling. CASP4 could thus serve as another scaffold protein in the TNFR complex as described for other caspases. Future experiments will identify the interaction partners of SPP1, GAB3 and CASP4, clarifying the molecular details of their mode of action in TNF-alpha-induced activation of NF-kappaB.

Translation of abstract (German)

Signalwege sind zur Kommunikation zwischen den Zellen komplexer Organismen unentbehrlich. Sie steuern Prozesse wie Zelldifferenzierung und Entwicklung. Inflammatorische Signalwege spielen bei Immunantworten und der Reaktion auf Zellstress eine Rolle. Ein zentraler Mediator von Entzündungsreaktionen ist das inflammatorische Cytokin TNF-alpha. Aufgrund seiner Schlüsselfunktion sind Missregulierungen des TNF-alpha Signalwegs an vielen inflammatorischen Krankheiten und Krebs beteiligt. TNF-alpha vermittelt Entzündungsreaktionen durch seine Bindung an den TNF-alpha-Rezeptor (TNFR) 1. Die Aktivierung des Rezeptors induziert die Ausbildung des TNFR-Komplexes, in den z.B. Proteine mit "death domains" (DD) rekrutiert werden. Der TNFR-Komplex aktiviert den "inhibitor of kappaB" (IkappaB) Kinasekomplex (IKK), der IkappaB phosphoryliert und zum Abbau markiert. Durch den Abbau von IkappaB werden Transkriptionsfaktoren der NF-kappaB-Familie freigesetzt. Diese aktivieren daraufhin die Expression vieler verschiedener Gene, die für Entzündungsreaktionen und angeborene Immunantworten benötigt werden. Ziel dieser Doktorarbeit war es, neue Komponenten des TNF-alpha Signalweges zu identifizieren. Es wurde ein so genannter "dual luciferase assay" in HEK293T Zellen etabliert, um die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB nach Stimulation mit TNF-alpha zu messen. Dieser Assay ermöglichte es, in genomweiten RNA-Interferenz Screens nach Regulatoren des TNF-alpha Signalweges zu "fahnden". Mithilfe zweier Screens wurden mehrere solche mögliche Regulatoren identifiziert. Sekundärassays wurden etabliert, mit deren Hilfe die Phänotypen der Screening-Kandidaten überprüft und schließlich die drei Kandidaten SPP1, GAB3 und CASP4 zur weiteren Charakterisierung ausgewählt wurden. Durch Epistaseexperimente wurde gezeigt, dass alle drei Proteine an der Aktivierung des IKK beteiligt sind. Ihre Expression wurde nicht für die Lokalisation des TNFR1 an der Zelloberfläche benötigt. Diese Arbeit stellt Modelle vor, welche Rolle die drei identifierten Proteine im TNF-alpha Signalweg einnehmen könnten. SPP1 erfüllt viele diverse Funktionen. Unter anderem interagiert es am TLR9 mit dem DD-Protein MyD88. Es könnte also mit DD-Proteinen im TNFR-Komplex interagieren. GAB3 gehört einer Familie von Adaptorproteinen an, deren Mitglieder mit der Aktivierung von NF-kappaB in Verbindung gebracht wurden. So wurde von GAB2 berichtet, dass es mit dem TNFR Familienmitglied RANK interagieren kann. Analog dazu wäre es denkbar, dass GAB3 an TNFR1 bindet. CASP4 gehört zu den inflammatorischen Caspasen, einer Familie von Cysteinpeptidasen. Experimente weisen jedoch darauf hin, dass CASP4 unabhängig von seiner Enzymaktivität NF-kappaB aktiviert. Auch für andere Caspasen wurde eine nicht-enzymatische Adaptorfunktion beschrieben. Um die vorgestellten Modelle zu testen, müssen nun die Interaktionspartner der drei Kandidaten identifiziert werden.