German Title: Identifizierung von Komponenten der intrazellulären Transportmaschinerie von acylierten Proteinen durch einen genomweiten RNAi-Screen

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Abstract

Targeting of peripheral membrane proteins to different cellular compartments is often mediated by post-translational fatty acylation. For example, N-terminal SH4-domains containing dual lipid modifications mediate reversible attachment to intracellular membranes of a variety of proteins such as the Src family of kinases. Myristoylation and subsequent palmitoylation of the SH4-domain are not only required for stable membrane anchoring, but are also essential for targeting and transport to the plasma membrane. Their association with membrane microdomains, which are enriched in cholesterol and sphingolipids and moreover contain a specific set of proteins, is crucial for functionality and provides a means of spatio-temporal regulation of acylated proteins. Even though many SH4-domain-containing proteins are functionally quite well characterized, little is known about the intracellular machinery mediating transport to the plasma membrane. It has been hypothesized that their association with membrane microdomains already occurs at the level of intracellular membranes and is a prerequisite for targeting and transport. It was the aim of this study to identify gene products involved in intracellular transport of acylated proteins to the plasma membrane employing a genome-wide RNAi screening approach. For this purpose, we established a stable human model cell line, which simultaneously expresses two distinct plasma-membrane-associated acylated reporter proteins. This cell line was adapted to a high-content screening platform, which is based on reverse transfection of a genome-wide siRNA library and data acquisition by automated widefield microscopy. To analyse imaging data in an unbiased and quantitative manner, an automated single-cell image analysis tool was developed. This tool identifies and compartmentalizes individual cells and determines intensity distributions of the two fluorescent reporter proteins, thus identifying experimental conditions under which intracellular retention of one or both reporter proteins occurs. Primary screening followed by subsequent validation with independent siRNAs resulted in the identification of 60 gene products, which caused intracellular retention of one or both acylated reporter proteins. Interestingly, we were able to identify enzymes involved in lipid homeostasis and microdomain-associated proteins. These findings corroborate the hypothesis that partitioning into membrane microdomains is a crucial step in targeting and transport of acylated proteins to the plasma membrane. Moreover, we were able to identify kinases, phosphatases and other proteins, which may exert regulatory functions in this process. The exact role of these factors in transport of SH4-domain-containing proteins to the plasma membrane will be elucidated in further studies.

Translation of abstract (German)

Membranassoziation und intrazelluläre Sortierung peripherer Membranproteine wird häufig durch die post-translationale Anheftung von Fettsäuren vermittelt. Ein Beispiel sind N-terminale SH4-Domänen, die duale Lipidmodifikationen enthalten und die reversible Membranassoziation zum Beispiel von Mitgliedern der Familie der Src Kinasen vermitteln. Eine Myristoylierung und darauffolgende Palmitoylierung der SH4-Domäne ist dabei nicht nur für eine stabile Membranverankerung notwendig, sondern ist zudem essentiell für den intrazellulären Transport zur Plasmamembran. Ihre Assoziation mit Membranmikrodomänen, die Cholesterin, Sphingomyelin und spezifische Proteine selektiv anreichern, ist für die Funktion von Src Kinasen essentiell. Während die Funktionen der Src Kinasen detailliert erforscht wurden, ist über die intrazelluläre Maschinerie, die ihren Transport zur Plasmamembran vermittelt, nur wenig bekannt. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Assoziation mit Mikrodomänen bereits an intrazellulären Membranen erfolgt und eine Voraussetzung für den Transport zur Plasmamembran ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch eine auf RNA Interferenz basierten, genomweiten Analyse Genprodukte zu identifizieren, die am intrazellulären Transport von acylierten Proteinen zur Plasmamembran beteiligt sind. Zu diesem Zweck wurde ein stabiles humanes Zellsystem etabliert, in dem simultan zwei unterschiedliche plasmamembranassoziierte acylierte Reporterproteine exprimiert werden können. Diese Zelllinie wurde an eine High Content Screening Plattform adaptiert, die auf reverser Transfektion mit einer genomweiten siRNA-Bibliothek und anschließender automatischer Weitfeldmikroskopie beruht. Um Bilddaten objektiv und quantitativ auswerten zu können, wurde ein automatisiertes Bildanalyseprogramm entwickelt, welches einzelne Zellen erkennen und kompartimentalisieren kann. Über eine Bestimmung der intrazellulären Intensitätsverteilung konnten experimentelle Bedingungen identifiziert werden, die durch die intrazelluläre Retention eines oder beider Reporterproteine charakterisiert waren. Die Primäranalyse und eine anschließende Validierung führten zur Identifizierung von insgesamt 60 Genprodukten, deren RNAi-vermittelte Expressionsunterdrückung eine intrazelluläre Retention eines oder beider Reporterproteine hervorrief. Interessanterweise konnten wir dabei Enzyme identifizieren, die an der zellulären Lipidhomeostase beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern unsere Hypothese, dass eine Assoziation mit Membranmikrodomänen ein essentieller Schritt im Transport von acylierten Proteinen zur Plasmamembran ist. Darüber hinaus haben wir verschiedene Kinasen, Phosphatasen und andere Proteine identifiziert, die eine regulatorische Funktion in diesem Prozess spielen könnten. Die genaue Rolle dieser Faktoren im Transport von SH4-domänenhaltigen Proteinen zur Plasmamembran kann nun in weiterführenden Arbeiten untersucht werden.