English Title: Analysis of signaling proteins in cell lines and tumor tissue using reverse phase protein arrays

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Abstract

Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit, wobei Lungen- und Prostatakrebs bei Männern die am weitesten verbreiteten Krebsarten sind. Dabei unterscheiden sich beide Krebsarten grundlegend. Während Lungenkrebs stark abhängig von umweltbedingten Risikofaktoren ist, zeigt Prostatakrebs eine ausgeprägte molekulare Heterogenität sowie ein altersbedingt steigendes Risiko. Der molekulare Hintergrund von Lungenkrebs ist häufig eine Deregulation der Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Signalwege, speziell des AKT- und MAPK-Signalweges. Daher sind spezifische Kinase-Inhibitoren vielversprechende Wirkstoffe für die individuelle Therapie von Lungenkrebspatienten. Zur Beurteilung der Reaktion auf eine Behandlung mit solchen Inhibitoren sollte in einem Set von 84 Lungenkrebszelllinen nach Proteinexpressionsprofilen gesucht werden, die mit deren Wirksamkeit korrelieren. Als maßgebliche Grundlage zur Behandlung von Prostatakrebspatienten dient der in der Histopathologie bestimmte Gleasonwert der Biopsieproben. Jedoch führt dieser nicht immer zu einer angemessenen Therapieentscheidung, da die prognostische Aussage des Gleasonwertes nur unzureichend ist. Daher sollten zur Verbesserung der Prognose in einem Set von Tumorproben Markerproteine gefunden werden, die einerseits die Aggressivität der Tumore berücksichtigen sowie mit dem Auftreten des TMPRSS:ERG-Fusionsgens assoziiert sind. Zur Beantwortung dieser Fragen wurde auf die Reverse Phase Proteinarray-Technologie zurückgegriffen, die zunächst im Hinblick auf Durchsatz, Sensitivität und Robustheit weiterentwickelt wurde. Eine antikörperbasierte Signalamplifikation wurde zur Steigerung der Sensitivität entwickelt, um auch die Detektion gering exprimierter Proteine zu ermöglichen. Die Validierung von Antikörpern mittels RNAi wurde etabliert, um die Datenqualität zu verbessern und die isoformspezifische Detektion von Proteinen sicherzustellen. Nach erfolgreicher Optimierung der RPPA-Technologie wurde in der statistischen Umgebung R ein Analysewerkzeug programmiert, das flexibel eingesetzt werden kann, um RPPA-Daten einzulesen, zu normalisieren und zu visualisieren. Die Verwendung der experimentellen Verbesserungen wie auch der entwickelten Datenanalysewerkzeuge in einem miRNA-Screening bestätigte die hohe Leistungsfähigkeit und Robustheit zum Einsatz in Hochdurchsatzproteomanalysen. Die Analyse der Lungenkrebszelllinien ergab für jeden Wirkstoff sechs bis acht potentielle Markerproteine, wobei vor allem Proteine des AKT-Signalweges als mögliche Resistenzmarker identifiziert wurden. Als Ergebnis der Analyse des RPPA-basierenden Proteomprofilings von Prostatatumoren konnte eine erhöhte Aktivierung von p38 mit geringen Gleasonwerten korreliert werden. Die TMPSS:ERG-fusionsgenpositiven Prostatatumore zeigten eine reduzierte Expression der onkogenen Proteine ERK, PI3K p110 und CDK6, was auf eine Assoziation mit weniger aggressiven Tumoren hinweist. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die formale Begriffsanalyse zur Datenintegration für kleine Probensätze sinnvoll eingesetzt werden kann. So wurde eine Korrelation des TMPRSS:ERG-Fusionsgens mit geringen Gleasonwerten beobachtet. Darüber hinaus zeigte sich eine gegensätzliche Regulation der p38- und ERK-Signalwege. In Proben hohen Gleasonwertes ist p38 gering aktiviert bei gleichzeitig hoher Expression und starker Aktivierung von ERK.

Translation of abstract (English)

Cancer is the most common death causing disease worldwide, of which lung and prostate cancers are the most common types within the male population. Considering the molecular characteristics these cancers are elementary different. Lung cancer is strongly associated with environmental risc factors and shows homogenous molecular patterns. In contrast prostate cancer is characterized by molecular heterogenity and by strong age dependency. Common molecular alterations in lung cancer include receptor tyrosin kinase signaling especially through AKT and ERK signaling pathways. Therefore, specific kinase inhibitors are promising agents for the personalized treatment of lung cancer patients. However, individual response to therapeutic drugs is clinically challenging. Therefore, 84 lung cancer cell lines representing all molecular properties of this type of cancer were analyzed using reverse phase protein arrays to find predictors of drug responsiveness. With respect to prostate cancer, Gleason scoring of biopsy samples by histopathology is the basis for the treatment decisions. However, misclassification or inadequate grading of biopsies often leads to over- or undertreatment of patients. To overcome these problems and to find biomarkers for definitive diagnosis we performed RPPAs in a set of prostate cancer specimens with the defined pathological characteristics such as Gleason Score and a frequent gene fusion TMPRSS:ERG status in prostate cancer. To answer these questions the reverse phase protein array technology was applied for large-scale proteomics with optimized capacity, sensitivity and robustness. To detect low abundant proteins with RPPA, an antibody mediated signalamplification was established. RNAi based validated antibodies made an isoformspecific detection of proteins possible. After successful optimization of the RPPA technology for further data analysis the RPPanalyzer package was developed using the statistical environment R. The improved technology as well as data analysis tools showed the high capacity and robustness for the implementation in high throughput proteomics in various projects. Analysis of lung cancer cell lines by RPPA revealed potential prediction markers of drug responsiveness for common clinically relevant compounds. Additionally AKT pathway proteins were found to be associated with sensitivity towards drugs included in the study. The protein profiling of prostate cancer revealed that the activation of p38 is associated with a low gleason score. In TMPRSS:ERG fusion gene positive tumors ERK, PI3K p110, and CDK6 were downregulated indicating a correlation with low aggressive tumors. For the integration of RPPA data with pathological data and TMPRSS:ERG fusion gene status, formal concept analysis was applied and showed positive correlation between gene fusion and low Gleason score. Interestingly using FCA analysis showed that high gleason score is associated with high ERK expression and low p38 activation.