German Title: Nano-patterned, mechano-abstimmbare, EZM-mimetik Substrate für Zelladhäsionstudien unter Dehnung

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Abstract

Adherent cells are sensitive to physical and chemical cues in their environment and can adapt their response accordingly. Receptors in cells membrane are crucial elements in the recognition of such signals by binding external ligands (key-and-lock principle). Thereby these receptors and associated proteins transduce external cues in internal signals. Chemical nature of the ligands and their spatial arrangement can provide important information to the cells. In particular, spatial clustering of the ligands at the nanometer scale is considered to be a general principle by which the signal transduction of many biological processes gets modulated. Examples are the formation of focal adhesions (FAs) or of the immunological synapse. To investigate such clustering effects at the molecular scale, there is an immanent need for the precise chemical modification of surfaces. Therefore, the aim of this work was to (i) develop a substrate on which the spatial arrangement of bound particles could be precisely controlled and varied at the nanometer scale, and (ii) to demonstrate the utility of such substrates in cell adhesion studies. During this work an elastic poly(ethyleneglycol)-diacrylate (PEG-DA) hydrogel (HG) was used as carrier substrate on which an array of gold nano-particles (AuNPs) with well defined inter-particle distances (Delta L) was immobilized. Delta L could be successfully varied at the nanometer scale by mechanical stretching of the carrier substrate. For cell adhesion studies the AuNPs were functionalized with a c(RGDfK) peptide so that integrin binding was preferentially invoked. Due to the protein repellent properties of PEG, the AuNPs constituted the only anchor points on which cells could adhere. Thereby nanometer precision on the spatial arrangement of the ligands was achieved. To show the versatility of PEG-DA HGs as bio-mimetic substrates, the surfaces of a series of HGs were homogeneously functionalized with Fibronectin (FN). Strain applied to the HGs was successfully transmitted to cells and FAs and their reaction to the strain and to the change in inter-ligand distances was monitored and analyzed. The anisotropy generated in the ligand array by the uni-axial stretching influenced cell adhesion. FAs reaction was more prominent when stretched on HGs + FN than on HGs + AuNPs + RGD. In summary, fabrication of a material system for the dynamic variation of Delta L in the tens of nanometers was accomplished in this work. By rendering these substrates bio-mimetic, cell adhesion studies with dynamic variation of inter-ligand distances could be performed.

Translation of abstract (German)

Adhärente Zellen vermögen es sowohl mit physikalischen als auch mit chemischen Signalen in ihrer unmittelbaren Umgebung zu interagieren. Sogennante Zellmembranrezeptoren erfüllen dabei eine entscheidende Aufgabe. Sie vermögen es extrazelluläre Signale von spezifischen Liganden in intrazelluläre Signale umzuwandeln (Schlüssel-Schloss-Prinzip). Sowohl die chemische Natur dieser Liganden als auch ihre räumliche Anordnung übermitteln den Zellen wichtige Information. So vermag es die räumliche Anordnung der Liganden und Rezeptoren auf der Nanometerskala die Signaltransduktion vieler biologischer Prozesse zu modulieren. Beispiele dafür sind die Bildungen von fokalen Adhäsionskontakten (FAs) oder der immunologischen Synapse. Zur Untersuchung dieser Proteincluster und ihrer Wirkungsweise auf molekularer Ebene besteht ein zwingender Bedarf an präziser chemischer Oberflächenmodifikation. Das Ziel dieser Arbeit war es (i) ein Substrat zu entwickeln, auf welchem die räumliche Anordnung von gebundenen Partikeln dynamisch auf der Nanometerskala kontrolliert und verändert werden kann und anschließend (ii) die Funktionalität eines solchen Substrates in Zelladhäsionstudien zu zeigen. Hierzu wurde ein elastisches auf Polyethylenglykoldiacrylat (PEG-DA) basierendes Hydrogel (HG) als Trägersubstrat verwendet, auf welchem regelmäßig angeordnete Goldnanopartikel (AuNPs) mit definierten Interpartikelabständen (Delta L) chemisch gebunden wurden. Diese Abstände konnten durch mechanische Dehnung des Trägersubstrats auf der Nanometerskala variiert werden. Für Zelladhäsionsexperimente wurden die AuNPs mit dem Peptid c(RGDfK) funktionalisiert, welches spezifisch an den Membranrezeptor Integrin bindet. Aufgrund der proteinabweisenden Eigenschaften des PEG-Hydrogels erwiesen sich die AuNPs als die einzigen Ankerpunkte für die Zellen. Somit wurde eine präzise räumliche Anordnung der Liganden in Nanometerbereich erreicht. Um die Vielseitigkeit von PEG-Hydrogelen als biomimetische Substrate zu zeigen, wurden diese ebenso homogen mit Fibronektin (FN) funktionalisiert. Die Dehnung der Hydrogele wurde auf die Zellen und ihre FAs erfolgreich übertragen. Die dadurch hervorgerufenen Zellreaktionen und die Veränderungen in ihrem Interligandabstand wurden analysiert. Durch die einachsige Substratdehnung wird die Ligandenanordnung variiert und somit die Zelladhäsion beeinflusst. Die Reaktion der FAs war ausgeprägter bei einer Dehnung von HGs + FN Substraten im Vergleich zu HGs + AuNPs + RGD Substraten. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit die Anfertigung eines Substrates zur dynamischen Variation von Nanopartikelnabständen im Bereich von wenigen Nanometerzehnteln erreicht. Durch die Biofunktionalisierung dieser Substrate konnten biomimetische Zelladhäsionsstudien mit einer dynamischen Variation von Interligandabständen durchgeführt werden.