German Title: MicroRNAs mit Einfluss auf die Aggressivität des Malignen Melanoms

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Abstract

Malignant melanoma is the most severe form of skin cancer being refractory to current therapies at advanced stages (stage III and IV). The survival of individual patients can vary from months to years, but the molecular mechanism behind this broad survival time range is unknown so far. Many signaling pathways have been found to be important in melanoma and recently microRNAs (miRNAs) have emerged to be essential regulators in these pathways. This study aimed at the identification of miRNAs accounting for the aggressiveness of melanoma. Using bead-based microarray analyses, we performed miRNA expression profiling on a panel of melanoma cell lines derived from metastatic melanoma patients with either long or short survival times. Upon comparison of these two patient groups a number of differentially expressed miRNAs could be identified. However, subsequent real-time quantitative PCR (qPCR) revealed that only one candidate miRNA (miR-101) was confirmed to be down-regulated in cell lines from short term survivors, compared to long term survivors. We found that miR-101 could directly target microphthalmia-associated transcription factor (MITF) in melanoma cells, leading to a decrease in intracellular MITF protein expression. One of the predicted target sites for miR-101 in the 3’ UTR of MITF was confirmed by luciferase reporter assay. Furthermore, we show that the expression of “enhancer of zeste homolog 2” (EZH2), previously reported as miR-101 target in other types of cancer, was down-regulated by miR-101 also in melanoma. Overexpression of miR-101 inhibited proliferation, invasion and migration of melanoma cells, which could be phenocopied by siRNA-mediated knockdown of MITF or EZH2 using specific siRNA. miR-137 was reported to act as a tumor suppressor in different cancer entities including melanoma. In this study, we showed that low miR-137 expression correlated with poor survival of stage IV melanoma patients. We identified three novel targets (proto-oncogene c-Met, Y box binding protein 1 [YB1] and the ATP-binding cassette, sub-family B, member 5 [ABCB5]) and confirmed two previously reported targets (MITF and EZH2) for miR-137. Overexpression of miR-137 suppressed invasion of melanoma cells, which could be phenocopied by siRNA-mediated knockdown of the miR-137 targets c-Met, YB1, MITF and EZH2. Furthermore, miR-137 inhibited melanoma cell migration and proliferation likely through the down-regulation of certain proteins (e.g. YB1 and EZH2) whose individual impact on these processes varied among the two cell lines tested. Finally, miR-137 induced apoptosis in melanoma cell lines and decreased B-cell lymphoma 2 (BCL2) protein expression levels. In conclusion, our study suggests that miR-101 and miR-137 can function as tumor suppressors in melanoma. We show that overexpression of these miRNAs could lower the aggressiveness of melanoma cells by regulation of multiple signaling pathways, offering new options for targeted therapy against melanoma.

Translation of abstract (German)

Das Maligne Melanom zeichnet sich im fortgeschrittenen Stadium (Stadium III und IV) durch eine ausgeprägte Resistenz gegenüber aktuell angewandten Therapieformen aus und stellt somit die schwerwiegendste Form aller Hautkrebsarten dar. Die Überlebensdauer der Patienten beträgt zwischen einigen Monaten bis mehren Jahren, allerdings ist der molekulare Mechanismus der für diese große Schwankungsbreite verantwortlich ist, noch ungeklärt. Bisher konnten etliche Signalkaskaden identifiziert werden, die für das Melanomwachstum relevant sind, doch kürzlich wurden microRNAs (miRNAs) als essentielle Regulatoren dieser Signalwege ermittelt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Identifizierung von miRNAs, die zur Aggressivität von Melanomen beitragen. Mit Hilfe von „Bead“-basierten Micro-Array-Analysen konnte ein miRNA Profil für eine Reihe von Melanom-Linien erstellt werden, die aus Tumorpatienten mit metastasierten Melanomen und langer bzw. kurzer Überlebensdauer stammten. Durch den direkten Vergleich dieser beiden Patientengruppen konnte eine Reihe von differenziell exprimierten miRNAs identifiziert werden. Allerdings konnte in der anschließend durchgeführten quantitative Real-Time PCR Analyse nur eine miRNA (miR-101) als eine in Melanom-Linien aus Patienten mit kurzer Überlebensdauer spezifisch herabregulierte miRNA bestätigt werden. Wir fanden, dass miR-101 auf den „Micropthalmia-assoziierten Transkrpitionsfaktor“ (MITF) einwirkt und zu dessen verminderten intrazellulären Proteinexpression führt. Eine der vorhergesagten miR-101-Bindungsstellen im in der 3’UTR der MITF-spezifischen mRNA konnte mit Hilfe von Luziferase Reporter-Tests bestätigt werden. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass das Protein „Enhancer of Zeste Homolog 2“ (EZH2), das bereits in anderen Tumorentitäten als Zielstruktur für miR-101 beschrieben wurde, auch in Melanomen durch miR101 herab reguliert wird. Durch Überexpression von miR-101 wurden Proliferation, Invasion und Migration von Melanomzellen inhibiert, ein Effekt, der auch stellvertretend durch die si-RNA-vermittelte Ausschaltung von MITF oder EZH2 erzielt werden konnte. miR-137 wurde für verschiedene Tumorarten, einschließlich des Malignen Melanoms, als Tumorsuppressor- microRNA beschrieben. In der vorliegenden Arbeit konnten wir zeigen, dass eine niedrige miR-137 Expression mit einer verminderten Überlebensrate von Patienten im Stadium IV einher geht. Darüber hinaus wurden drei Proteine identifiziert, deren Expression miR-137- abhängig moduliert wird, nämlich das Proto-Onkogen c-Met, das „Y-Box Binding Protein 1“ (YB-1) und das „ATP-Binding Cassette, Subfamily B, Member 5“-Protein (ABCB5). Die bereits früher beschriebene miR-137-vermittelte Modulation der Expression von MITF und EZH2 konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit ebenfalls bestätigt werden. Durch Überexpression von miR-137 wurde die Invasion von Melanomzellen inhibiert; dieser Effekt konnte durch siRNA-vermittelte Unterdrückung der Expression von c-Met, YB1, MITF und EZH2 imitiert werden. Darüber hinaus inhibierte miR-137 durch Herabregulierung bestimmter Proteine (u. a. YB1 und EZH2) auch die Migration und Proliferation von Melanomzellen. Die targetierten Proteine zeigten hierbei sowohl innerhalb einer Melanomlinie als auch zwischen den beiden getesteten Melanomlinien unterschiedlich stark ausgeprägte Effekte. Darüber hinaus Des Weiteren löste miR-137 Apoptose in Melanomlinien aus und führte zu einer verminderten Expression des „B-Cell-Lymphoma 2“ Proteins (BCL-2). Unsere Studie legt die Schlussfolgerung nahe, dass miR-101 und miR-137 als Tumor-suppressoren in Melanomen fungieren können. Wir zeigen, dass die Überexpression dieser miRNAs die Aggressivität von Melanomzellen durch die Regulation mehrerer Signalwege verringern kann. Hierdurch könnten Optionen für neue Therapieansätze gegen das Maligne Melanom geschaffen werden.