German Title: Funktionale Charakterizierung von Gene Produkten, die an SH4-domain-abhängige Protein Transport beteiligt sind

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Abstract

Src Kinasen spielen eine zentrale Rolle in intrazellulären Signaltransduktionsprozessen, und sind so an verschiedenen zellulären Prozessen, wie Zellproliferation und - differenzierung, beteiligt. Dabei ist ihre subzelluläre Lokalisierung für die funktionelle Interaktion mit anderen Proteinen von zentraler Bedeutung. Die stabile Assoziation mit Membranen wird durch eine N-terminale SH4-Domäne vermittelt, die über eine duale Lipidmodifikation an der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran verankert ist. Die erste Modifikation ist dabei eine Myristoylierung, welche eine transiente Interaktion mit intrazellulären Membrankompartimenten vermittelt und die Voraussetzung für eine darauffolgende Palmitoylierung ist. Diese zweite Modifikation bewirkt nicht nur eine stabile Membranverankerung, sondern begünstigt auch eine Anreicherung von SH4- domänenhaltigen Proteinen in cholesterinreichen Membranmikrodomänen. Diese Assoziation findet vermutlich schon auf der Ebene intrazellulärer Kompartimente, z.B. im Golgi-Apparat, statt und könnte für eine Sortierung zur Plasmamembran erforderlich sein. Der molekulare Mechanismus, der dem mikrodomänenabhängigen Transport von SH4-Proteinen vom Golgi-Apparat zur Plasmamembran zugrundeliegt ist jedoch nichtbekannt. In einer vorausgehenden Studie unseres Labors wurde eine genomweite Analyse durchgeführt um molekulare Komponenten zu ermitteln, die am SH4- abhängigen Transport zur Plasmamembran beteiligt sind. Hierbei wurden unter anderem Proteine identifiziert, die an der Lipidhomeostase, im intrazellulären Transport und an zellulären Signaltransduktionswegen beteiligt sind. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Rolle dieser Faktoren im intrazellulären Transport von acylierten Proteinen zu bestätigen und funktionell näher zu charakterisieren. Wir konnten zeigen, dass der heptamere Coatomer-Komplex, sowie die Aktivität der Proteinkinase C für eine erfolgreiche Sortierung von SH4-Proteinen zur Plasmamembran erforderlich ist. Darüber hinaus wurde eine potentielle Beteiligung von Membranmikrodomänen am SH4-abhängigen Transport durch die Beobachtung untermauert, dass Änderungen der zellulären Cholesterinmenge mit einer intrazellulären Anreicherung acylierter Proteine einhergehen. Abschließend untersuchten wir, ob Nedd8- activating enzyme 1 (NAE1), eine Komponente des zellulären Neddylierungsweges, sowie eine funktionelle Neddylierung für den Transport von SH4-Proteinen zur Plasmamembran erforderlich sind. Mithilfe von RNA Interferenz und dominantnegativen Mutanten von Komponenten des Neddylierungsweges, sowie eines spezifischen Inhibitors von NAE1 konnten wir bestätigen, dass NAE1 für eine erfolgreiche Sortierung der SH4-Domäne der Src Kinase Yes erforderlich ist. Eine funktionelle zelluläre Neddylierungsmachschinerie ist jedoch keine essentielle Voraussetzung für diesen Prozess. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass NAE1 eine weitere, bisher unbekannte Funktion in der Sortierung von Src Kinase besitzt, die unabhängig vom Prozess der Neddylierung ist.

Translation of abstract (English)

Src proteins are non-receptor tyrosine kinases, which are known to play crucial roles in regulating cell proliferation and differentiation. They localize at the cytoplasmic face of the plasma membrane mediated by a dual lipid modification of their N-terminal SH4 domains. Appreciable amounts of Src kinases are also found in intracellular compartments such as late endosomes, lysosomes and the Golgi apparatus. The lipid modifications of SH4 domains are both necessary and sufficient to mediate targeting of Src kinases to the inner leaflet of plasma membranes. However, the underlying mechanisms by which SH4-domain-containing proteins are transported to the plasma membrane are poorly understood. A genome-wide analysis to identify factors involved in SH4-domain-dependent protein targeting was carried out in a previous study of our laboratory by using an automated microscopy platform. We were able to identify proteins involved in lipid metabolism, intracellular transport and also cellular signaling processes. The goal of the current study was to validate and functionally characterize a subset of theses gene products. We were able to show that β-COP, a component of the heptameric coatomer complex, plays an important role in SH4-dependent protein transport. Likewise, we demonstrated a requirement for protein kinase C activity in correct targeting of SH4 proteins to the plasma membrane. Further, the findings on mevalonate pyrophosphate decarboxylase (MVD) corroborate the role of cholesterol-dependent membrane microdomains in the plasma-membrane targeting of SH4 proteins. Finally, we challenged the hypothesis that nedd8-activating enzyme 1 (NAE1) or a functional neddylation pathway is required for correct targeting of SH4-proteins. Employing both RNA interference and dominant negative constructs of components involved in the neddylation pathway as well as a pharmacological inhibitor of NAE1, we were able to confirm a role of NAE1 in the proper intracellular targeting of SH4-YES; however, a functional neddylation pathway is not essential for this process. Hence, NAE1 may have a distinct function other than neddylation in the transport of SH4 proteins. These findings pave the way for future investigations on the underlying molecular mechanism for the targeting of SH4-domain containing proteins to the inner leaflet of the plasma membrane.