German Title: Charakterisierung der SOCS1 Induktion durch Aktivierung von Dectin-1 und Modulation der Immunantwort

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Abstract

Die präzise Regulation der Sekretion pro- und anti-inflammatorischer Zytokine stellt einen der wichtigsten Mechanismen bei der Immunantwort gegen pathogene Pilzinfektionen dar. Suppressor of Cytokine Signalling (SOCS) Proteine stellen eine Klasse von induzierbaren feedback Inhibitoren für den JAK/STAT (janus kinase/signal transducer and activator of transcription) Signalweg dar. Diese intrazellulären Proteine werden durch Zytokine, aber auch durch Toll-like Rezeptor (TLR) Liganden induziert. Neben TLRs ist Dectin-1 als weiteres Mitglied der PRRs (pattern recognition receptors) beschrieben. Dectin-1 erkennt Zellwandbestandteile pathogener Pilze. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob Dectin-1 Aktivierung mit der Induktion von SOCS Proteinen und damit der Modulation von Zytokinantworten einhergeht. Es kann gezeigt werden, dass SOCS1 (mRNA und Protein) nach Dectin-1 Stimulation muriner Makrophagen (BMMs) oder Dendritischer Zellen (BMDCs) induziert wird. Dabei erfolgte die SOCS1 Expression durch einen Dectin-1 Liganden, der keine TLR-Bindekapazität aufweist (modifiziertes Zymosan), direkt und TLR unabhängig. Die SOCS1 Induktion wurde über einen Signalweg vermittelt, der in Zusammenhang mit der SOCS1 Expression noch nicht beschrieben war. Dabei war der Transkriptionsfaktor NF-κB in BMMs, im Gegensatz zu BMDCs, nicht für die SOCS1 Induktion verantwortlich. Nach Dectin-1 Stimulation wurden Tyrosin Kinasen der Src und Syk Familie aktiviert; diese stimulierten wiederum die nachgeschaltete Tyrosin Kinase Pyk2 (Proline rich tyrosine kinase 2). In BMMs induzierte phosphoryliertes Pyk2 die Aktivierung der MAPK (Mitogen-activated kinase) ERK (extracellular signal-regulated kinase). Phosphoryliertes ERK induzierte die NF-κB unabhängige Expression von SOCS1. Eine Inhibition der Pyk2 Aktivierung führte zu einer spezifischen Hemmung der ERK Phosphorylierung sowie der Induktion des SOCS1 Proteins. Die Aktivität der MAP Kinasen JNKII und p38 blieb unbeeinflusst. SOCS1 wurde weiterhin auf seine Wirkung im Dectin-1 und TLR Signalweg untersucht. Es konnte eine inhibitorische Wirkung des SOCS1 Proteins auf den TLR Signalweg beobachtet werden, jedoch nicht auf den Dectin-1 Signalweg. Die Stimulation mit modifiziertem Zymosan führte zu einer verlängerten NF-κB Aktivierung in SOCS1 defizienten BMMs, die zusätzlich über TLR9 stimuliert wurden. Zudem war die TLR9 induzierte Sekretion der Zytokine IL12 und IL10 durch Dectin-1 induziertes SOCS1 Protein inhibiert. Zusätzlich konnte ein signifikanter Anstieg der IL17 Produktion in T-Helfer (Th) Zellen beobachtet werden, der abhängig von der Dectin-1 induzierten SOCS1 Expression in BMMs war. Dazu wurden BMMs aus SOCS1 knockout Mäusen und den entsprechenden Kontrollen via TLR9 und Dectin-1 kostimuliert und mit isolierten Wildtyp CD4+ Th-Zellen kokultiviert. Eine erhöhte IL17 Produktion konnte nur in Kokulturen mit BMMs gezeigt werden, die noch endogenes SOCS1 Protein exprimierten. SOCS1 ist somit assoziiert mit einem Th-Zell Phänotyp mit erhöhter IL17 Produktion. Die Ergebnisse zeigen, dass SOCS1 in Dectin-1 stimulierten myeloiden Zellen über einen neuartigen Signalweg induziert wird. In BMMs wird SOCS1 NF-κB unabhängig exprimiert. Darüber hinaus beeinflusst SOCS1 TLR-Signalwege und Th-Zell Antworten und wirkt somit an der Regulation von Immunantworten bei Pilzinfektionen mit.

Translation of abstract (English)

A hallmark of protective immunity during fungal infections is the regulated secretion of pro-and anti-inflammatory cytokines. Suppressor of cytokine signalling (SOCS) proteins constitute a class of key regulators of cytokine function. SOCS proteins are known as inducible negative feedback inhibitors of JAK/STAT (janus kinase/signal transducer and activator of transcription) pathways, but they can also be induced by Toll-like receptors. Dectin-1, another member of the PRR (pattern recognition receptor) family, is described to detect surface structures of fungal pathogens. However, induction and inhibition properties of SOCS proteins upon Dectin-1 stimulation have not been described yet. In this study it is shown that SOCS1 mRNA and protein is induced in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) and dendritic cells (BMDCs) upon engagement of Dectin-1. SOCS1 was expressed independently of any TLR engagement as a direct target gene of the Dectin-1 ligand depleted Zymosan, which lacks TLR-binding capabilities. Additionally, the induction of SOCS1 by depleted Zymosan was completely independent of secreted type I interferon. Induction of SOCS1 was mediated by a novel pathway that had not been described in conjunction with SOCS1 induction previously. In contrast to BMDCs, the transcription factor NF-κB was not responsible for SOCS1 expression in BMMs. This novel pathway encompassed the receptor proximal tyrosine kinases Src and Syk that activated the downstream tyrosine Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2). In BMMs, Pyk2 in turn caused activation of the MAPK (mitogen-activated kinase) ERK (extracellular signal-regulated kinase) thereby triggering SOCS1 induction. Inhibition of Pyk2 abolished Pyk2 and ERK phosphorylation as well as SOCS1 expression, whereas the activity of the MAPKs p38 and JNKII (c-jun N-terminal kinase) was completely unaffected. Subsequently, a possible influence of Dectin-1 induced SOCS1 on Dectin-1 and TLR signalling was tested. SOCS1 did not modulate Dectin-1 signalling pathway but affected TLR signalling. Stimulation with depleted Zymosan led to an increased and prolonged NF-κB activation in SOCS1 knockout BMMs triggered by TLR9. Furthermore, IL12 and IL10 secretion induced upon stimulation via TLR9 was inhibited by Dectin-1 induced SOCS1. In addition, it could be shown that IL17 producing T-helper (Th)-cells were increased by SOCS1 in BMMs. Therefore, BMMs from SOCS1 knockout as well as the respective controls were co-stimulated via TLR9 and Dectin-1 and co-cultured with wildtype CD4+ Th-cells. Afterwards, a significant increase in IL17 production could be observed only in co-cultures with co-stimulated BMMs that still expressed endogenous SOCS1. Thus, SOCS1 is responsible for shaping the immune response towards an anti-fungal, IL17 producing Th-cell phenotype. The results show that SOCS1 is expressed via a new pathway in Dectin-1 triggered myeloid cells. In BMMs, the SOCS1 expression is independent of NF-κB. SOCS1 induced via Dectin-1 influences TLR crosstalk and T-cell priming thus contributing to the appropriate immune regulation in fungal infections.