German Title: Die Notwendigkeit von TbCNOT10 für den Prozess des mRNS-Abbaus

Preview

PDF, English Download (9MB) | Terms of use

Abstract

Messenger RNA Degradierung startet mit Deadenylierung durch den CCR4-CAF1-NOT Komplex und darauf folgt entweder 5’ -> 3’ oder 3’ -> 5’ mRNA-Verdau. In dem protozoen Parasiten T. brucei wird die Genexpression hauptsächlich auf der Ebene des mRNA-Verdaus kontrolliert. In dem Parasitengenom existiert CCR4 nicht und daher wird der Komplex hier CAF1-NOT genannt. Wie in anderen Eukaryoten ist der Komplex auf dem Gerüstprotein NOT1 aufgebaut, an den sich die restlichen Untereinheiten CAF1, CAF40, NOT2, NOT3/5, DHH1 und ein CNOT10-ähnliches Protein anlagern. Obwohl es bekannt ist, dass CAF1 die katalytische Untereinheit ist, sind die Funktion der anderen Untereinheiten unbekannt. Während meiner Doktorarbeit habe ich mich auf die Charakterisierung von TbCNOT10 konzentriert; kodiert durch den Genlokus Tb927.10.8720. In Trypanosomen ist TbCNOT10 ungefähr 20 kDa kleiner als sein menschlicher Gegenpart und hat nur eine Sequenzidentität von rund 22 %. Ich konnte zeigen, dass TbCNOT10 ein stabiler Bestandteil des Komplexes ist und direkt mit CAF1 und NOT1 interagiert. Reduzierung von TbCNOT10 führte zu einen Vermehrungsdefekt des Parasiten in beiden Lebensstadien und interessanterweise, destabilisierte den CAF1-NOT Komplex. Als ich den RNAi-Effekt von TbCNOT10 weiter studierte, konnte ich sehen, dass seine Reduzierung zu einer Verringerung der NOT1 Menge führte und dass sich CAF1 vom Komplex ablöste. Durch die Verwendung von RNA-Sequenzierung, um die transkriptomweite mRNA-Degradation zu messen, konnte ich in TbCNOT10 sowie in CAF1 armen Zellen beobachten, dass die mRNA-Degradierung stoppte. Einen ähnlichen Effekt konnte ich für RRP45 RNAi erkennen, während ein Knockdown von PAN2 das Transkriptom nicht beeinträchtigte. In vivo Bindungsassays mit CAF1 und einem mRNA-Reporter in TbCNOT10 armen Zellen zeigte, dass die CAF1 Aktivität vom Komplex unabhängig ist. Studien in Säugetierzellen zeigten, dass menschliches CNOT10 nicht für die Assoziation von CAF1a mit NOT1 benötigt wird. Meine Ergebnisse lassen vermuten, dass TbCNOT10 in Trypanosomen für die Bindung von CAF1 mit dem Komplex benötigt wird und dass CAF1 alleine unfähig ist, Poly(A)-binding protein (PABP) geschützte mRNAs zu deadenylieren.

Translation of abstract (English)

mRNA degradation starts with deadenylation by the CCR4-CAF1-NOT complex, which is followed by either 5'->3' or 3'>5' digestion. In the protozoan parasite T. brucei, gene expression is controlled mainly at the level of mRNA degradation. In this parasite, CCR4 is absent and hence the complex is called CAF1-NOT. As in other eukaryotes, the complex is built on the scaffold protein NOT1, to which are attached the remaining subunits: CAF1, CAF40, NOT2, NOT3/5, TbDHH1 and a CNOT10-like protein. Although it is clear that CAF1 is the catalytic subunit, the functions of the other subunits are unknown. During my PhD, I focused on the characterization of TbCNOT10, encoded by the gene locus Tb927.10.8720. TbCNOT10 is around 20 kDa smaller than its human counterpart and has a sequence identity of only about 22 %. I could show that TbCNOT10 is a stable component of the complex and interacts directly with CAF1 and NOT1. Depletion of TbCNOT10 led to a proliferation defect in both life stages of the parasite and, more interestingly, destabilized the CAF1-NOT complex. When I further investigated the effect of TbCNOT10 RNAi, I could see that its depletion led to a decrease in NOT1 abundance and detachment of CAF1 from the complex. Using RNA sequencing to measure transcriptome wide RNA degradation, I observed that mRNA degradation came to a halt in TbCNOT10- and CAF1-depleted cells. A similar effect could be observed for RRP45 RNAi, whereas a knock down of PAN2 did not affect the transcriptome. Tethering assays in vivo with CAF1 and an mRNA reporter in TbCNOT10-depleted cells showed that the activity of CAF1 is complex independent. Studies in mammalian cells demonstrated that human CNOT10 is not required for the association of CAF1a with NOT1. Finally, my results suggest that in trypanosomes, CNOT10 is needed for the attachment of CAF1 with the complex and that CAF1 alone is unable to deadenylate Poly(A)-binding protein (PABP) protected mRNAs.