English Title: Implementation of the target enrichment approach for the Next Generation Sequencing-based identification of genomic aberration and the Identification of epigenetic and structural aberration in glioblastoma

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Abstract

Beim Glioblastom handelt es sich um den am häufigsten auftretenden und um den bösartigsten Gehirntumor im zentralen Nervensystem. Die mittlere Überlebensdauer liegt bei rund einem Jahr. Bei Glioblastomen unterscheidet man zwischen neu entstehendem primären und dem aus niedrig-gradigen Astrozytomen hervorgehenden sekundären Glioblastomen. Die Entstehung von Glioblastomen ist durch genetischer und epigenetischer Veränderungen verursacht. Mutationen, eine aberrante Methylierung von Promotorregionen und auch strukturelle Veränderungen können zur Aktivierung von Onkogenen oder zur Inaktivierung von Tumorsupressorgenen führen. Primäre und sekundäre Glioblastome weisen einige gemeinsame genetische Veränderungen (z.B. LOH 10q) auf, andere Veränderungen hingegen charakterisieren jeweils primäre (EGFR-Mutation/Amplifikationen) und sekundäre (IDH1 Mutationen) Glioblastome. Die (Epi-) Genomforschung profitierte in großem Maße durch die Einführung der Next Generation Sequencing (NGS) Technologien. Dennoch ist die Anwendung in Vergleichsstudien ganzer (Epi-) Genome vor allem aus Kostengründen kaum durchführbar. Das Verfahren der Microarray-based Genomic Selection (MGS) ermöglicht die Anreicherung interessierender genomische Bereiche Ziel dieser Studie war es, mittels Next Generation Sequencing Technologien neue epigenetische und genetische Aberrationen im Glioblastom zu identifizieren. Hierzu wurde in dieser Arbeit eine auf MGS basierende Methode zu subgenomischen Anreicherung entwickelt, die eine DNA-Methylierungsanalyse erlaubt (Bisulfit-Anreicherung). Mittels Bisulfit-Anreicherung wurden dann die Promotorbereiche des häufig deletierten Chromosoms 10q untersucht. Jeweils 10 primäre und sekundäre Glioblastome sowie 6 Normalhirn-Kontrollen wurden prozessiert. Das Unsupervised Clustering nach dem Methylierungsgrad zeigte die Einteilung in primäre und sekundäre Glioblastome. Sekundäre Glioblastome weisen im Vergleich zu primären Glioblastomen eine Hypermethylierung auf. Der Vergleich der verschiedenen Probengruppen ergab eine Reihe von hypermethylierten Genen. Von denen wurden DKK1, SEC31B, RASGEF1A und KCNMA1 in sekundären Glioblastomen als hypermethyliert validiert. Eine verminderte Expression dieser Kandidatengene war mit einem prognostisch ungünstigeren Verlauf für Glioblastom Patienten assoziiert. Strukturelle Veränderungen im Glioblastom-Genom wurden durch Mate-Pair Sequenzierung untersucht. Neben bekannten Amplifikationen wurden eine unbekannte Amplifikation der Gene COX4I2, BCL2L1 und TPX2 sowie eine Deletion des Gens TTC34 in sekundären Glioblastomen identifiziert.

Translation of abstract (English)

Glioblastoma is the most frequent and lethal cancer originating in the central nervous system with a median survival time of one year. Two types of glioblastoma are distinguished, primary glioblastoma that arise de novo and secondary glioblastoma that develop by progression from low-grade astrocytomas. The development of glioblastoma is a consequence genetic and epigenetic aberrantions. Mutations, aberrant methylation patterns as well as structural variations can lead to the activation of oncogenes or the inactivation of tumor suppressor genes. While primary and secondary glioblastomas share some genetic features (e.g. LOH 10q), other characteristics are more common in primary glioblastomas (EGFR amplifications/mutations) and secondary glioblastomas (IDH1 mutation). Comprehensive (epi)-genetic variation studies have greatly benefited from the introduction of the next-generation-sequencing (NGS) platforms. However, due to tremendous costs this technology is still not applicable for studies comparing several (epi)-genomes. The Microarray-based Genomic Selection (MGS) approach enables to capture specific regions of interest. The aim of this study was the identification of unknown epigenetic and genetic aberrations in glioblastoma using NGS technologies. A new method named Bisulfite Capture, based on MGS, was established allowing the analysis of DNA-methylation patterns of subgenomic regions. Bisulfite Capture was used to investigate promoter regions of chromosome 10q which is frequently deleted in glioblastoma samples. 10 primary and 11 secondary glioblastoma samples as well as 6 normal brain samples were analyzed. Unsupervised clustering identified two subgroups representing primary and secondary glioblastoma. In comparison to primary glioblastoma, secondary glioblastoma was hypermethylated. Hypermethylated genes could be identified comparing different sample groups. Thereof the hypermethylation of DKK1, SEC31B, RASGEF1A and KCNMA1 could be confirmed in secondary glioblastoma. Correlation with the individual outcome confirmed that a reduced gene expression of these candidate genes was associated with an unfavourable prognosis in glioblastoma patients. Structural variations in glioblastoma were indentified using Mate-Pair Sequencing. Both, known amplifications and the unknown amplification of the genes COX4I2, BCL2L1 and TPX2 as well as the deletion of TTC34, could be identified in secondary glioblastoma.