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Abstract

Malaria ist mit einer Mortalitätsrate von über einer Million Menschen pro Jahr, wovon die meisten Kinder unter fünf Jahren sind, nach wie vor eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten weltweit. Aufgrund der sich immer weiter ausbreitenden Resistenzen des Erregers Plasmodium falciparum gegen Malaria Medikamente wird der Kampf gegen die Krankheit zunehmend schwerer. Das einstmals mit hoher Effizienz und geringen Nebenwirkungen einsetzbare Chloroquin (CQ) beispielsweise verlor in den vergangenen Jahrzehnten immer mehr an Bedeutung. Ebenso verhält es sich für Chinin (QN). Wie aber kommt es zur Ausbildung dieser Resistenzen? Das in der Nahrungsvakuole des Parasiten lokalisierte transmembrane Protein PfCRT (Plasmodium falciparum Chloroquin Resistenz Transporter) spielt hierbei eine entscheidende Rolle. Es konnte nachgewiesen werden, dass bestimmte Punktmutationen innerhalb dieses Proteins zu einem gesteigerten Efflux von CQ aus der Nahrungsvakuole herausführen. Die Schlüsselrolle hierbei kommt der Aminosäure an Position 76 zu. Beim CQ sensitiven Plasmodium falciparum Stamm HB3 befindet sich an dieser Position ein Lysin (K76), wohingegen beim CQ resistenten Stamm Dd2 ein Threonin (T76) an dieser Stelle festzustellen ist. Darüber hinaus gibt es noch weitere Polymorphismen in PfCRT, welche Einfluss auf dessen Funktionalität nehmen. CQ und QN sind Substrate von PfCRT. Ob die Substratbindetasche in PfCRT für CQ und QN dieselbe ist, ob sie teilweise überlappt oder ob jedes Substrat in einer eigenständigen Bindetasche bindet ist noch unklar. Um dies zu untersuchen, wurde PfCRTDd2 in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert, welche anschließend für Aufnahmestudien mit CQ und QN verwendet wurden. Zunächst wurden konzentrationsabhängige Aufnahmestudien mit CQ unter Zugabe verschiedener Konzentrationen von QN durchgeführt. Anschließend wurden die Versuchsbedingungen umgekehrt und die Konzentrationsabhängige Aufnahme von QN bei verschiedenen Konzentrationen von CQ gemessen. Die in diesen Versuchen erzielten Ergebnisse sprechen für eine partiell gemischte (hyperbolische) Inhibierung, was wiederum auf unterschiedliche Bindetasche für das jeweilige Substrat hindeutet. Um zu untersuchen, wie sich Mutationen an der bedeutenden Position 76 auf die Transporteigenschaften von PfCRT auswirken, wurde T76 in PfCRTDd2 jeweils durch die 19 restlichen proteinogenen Aminosäuren ersetzt (T76X) und ebenfalls in Oozyten von X. laevis exprimiert. Die im Anschluss in den Oozyten gemessene Aufnahme von CQ, QN und dessen Isomers Chinidin (QD) zeigt, dass Aminosäuren mit positiv geladener Seitenkette (Lysin, Arginin und Histidin) an Position 76 die entsprechende PfCRT vermittelte Akkumulation aller drei Substrate unterbinden. Diese Akkumulation wird auch durch die Substitution von T76 durch Prolin (T76P) unterbunden. Allerdings ist der Effekt hier sehr wahrscheinlich auf die cyclische Form der Seitenkette des Prolins zurückzuführen (→ „Helixbrecher“). Anhand einer Auswahl von PfCRT Dd2T76X Varianten ließ sich ebenfalls durch Aufnahmestudien mit CQ in X. laevis Oozyten ein direkter Einfluss auf die Transportkinetik von PfCRTDd2 nachweisen. Durch gezielte Mutagenese wurde weiterhin eine Reihe von PfCRT Varianten mit Mutationen an spezifischen Positionen in Oozyten exprimiert und ebenfalls für Aufnahmestudien verwendet. Die Intention dahinter war, den Einfluss der mutierten Aminosäuren auf die Funktionalität von PfCRT zu prüfen. Die daraus erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass außer T76 noch weitere Aminosäuren eine mehr oder weniger wichtige Rolle für den Substrattransport spielen. Vor allem E75 hat einen entscheidenden Einfluss auf den Transport, insbesondere für QN und QD. Außerdem wirken sich verschiedene Kombinationen von Mutationen in PfCRT auf die Aufnahmerate und Substratspezifität aus, was durch einen weiteren Kompetitionsversuch mit QN und CQ bestätigt werden konnte. In diesem Versuch wurden die PfCRT Variante des P. falciparum Stammes Ecu1110 und eine chimäre PfCRT Variante (die erste Hälfte des Proteins von PfCRTDd2 und die zweite Hälfte von PfCRTEcu1110) mit PfCRTDd2 bezüglich der CQ Aufnahme in Anwesenheit von QN verglichen. Basierend auf diese Daten wurden Zusammenhänge zwischen Mutationen in PfCRT und damit einhergehende Veränderungen in dessen Transportaktivität beobachtet und in einem Gesamtkontext veranschaulicht.