German Title: Der Serin/Threonin Kinase AKT schaltet zwischen zwei funktionalen Zuständen der Vesikelfreisetzungsmaschinierie

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Abstract

Neurotransmitter release is a fundamental process in the nervous system by which neurons are enabled to communicate with postsynaptic cells in a highly controlled manner. This communication is mediated by three types of neurotransmitter release: synchronous, asynchronous and spontaneous vesicle releases, of which each has its own functional importance. A misbalance of these forms of transmitter release is therefore likely associated with improper information processing and may hence lead to network malfunction or even psychiatric conditions. While the fundamental principles of synaptic neurotransmission have been well clarified, questions remain whether for example the different release modes are based on distinct identities of vesicular release machineries or whether they reflect different functional states of the same vesicle release machinery. In this thesis we approached these and related questions at the larval (neuromuscular junction) NMJ of Drosophila melanogaster. We found that the membrane-associated serine/threonine kinase AKT, a nodal part of the phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) signaling pathway, is required to maintain the release machineries of presynaptic vesicles in a tightly clamped and calcium-sensitive status. In this status vesicle release can be evoked synchronously or asynchronously by action potentials and associated calcium influxes. Lost or reduced AKT activity switches the release machinery into a calcium-insensitive and fusogenic status resulting in spontaneous vesicle release that is independent of action potentials or the presence of calcium. AKT-mediated switching of the functional status of vesicle release machineries is a rapid process that acts acutely on readily releasable vesicles and hence can dynamically influence synaptic communication. Mechanistically, we show that the calcium sensor Synaptotagmin 1 that is also part of the release machineriesʼ fusion clamp mediates the AKT effects and hence may be a direct target of AKT phosphorylation. We further show that the clustered and functionally intact voltage gated calcium channel Cacophony is required for the AKT interaction with the release machinery, suggesting that only docked and primed vesicles are accessible to and regulated by AKT. These results demonstrate that AKT is an essential direct regulator of the mode by which synaptic vesicles can be released. In chapter II, with an attempt to identify potential synaptic regulators of AKT we assessed whether the recently identified ATP-dependent on-off switch of AKT might play a role in the regulation of its synaptic function. We found that treatment with oligomycin resulted in enhanced spontaneous vesicle release that was similar to that elicited by AKT blockade. Short trains of nerve stimulation during oligomycin incubation triggered an instantaneous increase in the rate of spontaneous vesicle release whereas a similar stimulation without oligomycin was without effect. These data indicate that nerve stimulation strongly enhances the ATP consumption in nerve terminals resulting in ATP-depletion and perhaps in AKT-inactivation. To test this hypothesis we made use of an alternative ATP-depletion strategy that allowed us to make postsynaptic recordings during periods of intense nerve stimulation. We found that stimulation-induced ATP-depletion triggered a strong enhancement of spontaneous vesicle release that was indeed AKT- and PI3K-dependent, which was mediated by Synaptotagmin 1 and depended on the functional presence of the Cacophony. These results confirmed the functional existence of a Cacophony/AKT/release machinery complex and they suggest that AKT is regulated by ATP. They further suggest that AKT may serve at vesicle release sites as a local energy sensor that depending on the availability of ATP switches individual vesicle release machinery either into a tightly clamped mode for evoked release or at low ATP levels into a loosely clamped mode generating spontaneous release. This novel and evolutionarily conserved synaptic role of AKT could shed new light onto the pathogenesis of Schizophrenia or Autism Spectrum Disorders in which AKT activities seem to be reduced. It also needs to be considered in recent approaches to treat several forms of cancer with AKT-inhibitors. In parallel to the above work, I was involved in a collaborative project that aimed at establishing a three-dimensional computational model of the glutamatergic synapses of larval NMJs. Chapter III summarizes the experimental data that formed the basis of the computational model and showed that high frequency nerve stimulation leads to a disproportional decay of evoked EJP amplitudes due to limited vesicle supply. The model is described in the discussion.

Translation of abstract (German)

Die Freisetzung von Neurotransmittern ist ein fundamentaler Prozess des Nervensystems, der es ermöglicht, dass Neurone mit postsynaptischen Zellen in einer kontrollierten Art und Weise kommunizieren können. Dabei werden Neurotransmitter auf drei verschiedene Arten freigesetzt: synchron, asynchron und spontan, wobei jede ihre eigene funktionelle Bedeutung hat. Ein Ungleichgewicht der verschiedenen Arten von Vesikel-Freisetzungen führt deshalb möglicherweise zu Problemen in der neuronalen Informationsverarbeitung und könnte zu Fehlfunktionen von Netzwerken und sogar zu psychiatrischen Erkrankungen führen. Während die grundlegenden Prinzipien der synaptischen Signalübertragung gut erforscht sind, bleibt zum Beispiel die Frage unbeantwortet, ob die verschiedenen Freisetzungs- formen von Vesikeln auf unterschiedlichen Identitäten vesikulärer Freisetzungs- maschinerien oder auf verschiedenen funktionellen Zuständen derselben Vesikel- Freisetzungsmaschinerien beruhen. In dieser Arbeit untersuchten wir diese Fragen an der neuromuskulären Endplatte von Drosophila melanogaster Larven. Wir fanden heraus, dass die membranassoziierte Serin/Threonin-Kinase AKT, ein Knotenpunkt des Phosphatidylinositol-3-Kinase(PI3K)-Signalwegs, erforderlich ist, um die Vesikel-Freisetzungsmaschinerie in einem sicher „geklemmten“ und Kalzium-sensitiven Zustand zu erhalten. In diesem Zustand kann ein Vesikel synchron oder asynchron durch Aktionspotentiale und den damit verbundenen Einstrom von Kalzium freigesetzt werden. Reduzierte AKT-Aktivität schaltet die Freisetzungs-maschinerie in einen Kalzium-insensitiven und „fusogenen“ Status, was zu spontaner Vesikelfreisetzung führt, die unabhängig von Aktionspotentialen oder Kalzium ist. Das AKT-vermittelte Umschalten des funktionellen Zustands der Vesikelfreisetzungs-maschinierie ist ein schneller Prozess, der akut auf Vesikel des „readily releasable vesicle pools“ wirkt und daher dynamisch synaptische Kommunikation beeinflussen kann. Mechanistisch zeigen wir, dass der Kalziumsensor Synaptotagmin1, der Teil der Fusionsklemme der Vesikel- Freisetzungsmaschinierie ist, die Wirkungen von AKT vermittelt und somit ein direktes Ziel von AKT-Phosphorylierung sein kann. Wir zeigen weiterhin, dass der funktionell intakte spannungsgesteuerte Kalziumkanal Cacophony für die AKT- Interaktion mit der Freisetzungsmaschinierie erforderlich ist. Dies deutet darauf hin, dass nur „gedockte und geprimte“ Vesikel für AKT zugänglich sind und reguliert werden können. Diese Ergebnisse zeigen, dass AKT ein essentieller und direkter Regulator des Modus vesikulärer Freisetztung ist. In Kapitel II haben wir geprüft, ob der kürzlich identifizierte ATP-abhängige An- und Ausschalter von AKT eine Rolle bei der Regulation der synaptischen Funktion von AKT spielen könnte. Eine Behandlung mit Oligomycin führte zu einer verstärkten spontanen Vesikelfreisetzung, die der ähnelt, die durch AKT-Inhibierung ausgelöst wird. In Anwesenheit von Oligomycin riefen bereits kurze Episoden von Nervstimulationen eine sofortige Erhöhung der Rate an spontan freigesetzten Vesikeln hervor, während eine ähnliche Stimulation ohne Oligomycin keine Veränderung bewirkte. Diese Daten deuten an, dass Nervstimulation zu einem verstärkten ATP-Verbrauch in Nervenendigungen führen und der Mangel an ATP eine Inaktivierung von AKT hervorrufen könnte. Um diese Hypothese zu testen, bedienten wir uns einer alternativen Methode, ATP-Mangel hervorzurufen und mit der postsynaptische Aufnahmen während intensiver Nervenstimulation möglich sind. Ein auf diese Weise induzierter ATP-Mangel bewirkte eine starke Erhöhung der spontanen Vesikelfreisetzung, die auch AKT- und PI3K-abhängig war, durch Synaptotagmin 1 vermittelt wurde und funktionsfähige Cacophony-Kanäle benötigte. Diese Ergebnisse bestätigten die Existenz eines funktionellen Komplexes aus Cacophony, AKT und der Vesikel-Freisetzungsmaschinerie und dass AKT durch ATP reguliert werden kann. Desweiteren weisen sie darauf hin, dass AKT an „Aktiven Zonen“ als lokaler Energiesensor dienen könnte. Dieser versetzt in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von ATP einzelne Vesikel-Freisetzungsmaschinerien entweder in einen „geklemmten“ Modus zur evozierten Freisetzung oder bei niedrigem ATP- Spiegel in einen „fusogenen“ Modus, der zu spontaner Freisetzung führt. Diese neue und evolutionär konservierte synaptische Rolle von AKT könnte neue Hinweise zur Pathogenese von Schizophrenie und Autismus-Spektrum-Störungen liefern, bei denen AKT reduziert zu sein scheint. Vor diesem Hintergrund sind aktuelle Studien in der Krebstherapie, bei denen AKT-Blocker eingesetzt werden bedenklich. Parallel zu den oben genannten Arbeiten, war ich in einem kollaborativen Projekt beteiligt, das darauf abzielte ein dreidimensionales Computermodell der glutamatergen Synapsen der larvalen NMJs zu entwickeln. Kapitel III fasst die experimentellen Daten, die die Grundlage des Rechenmodells bilden zusammen und zeigt, dass hochfrequente Nervenstimulation aufgrund der begrenzten Versorgung mit Vesikeln zu einem überproportionalen Abfall der Amplituden evozierter EJPs führt. Das Modell wird in der Diskussion beschrieben.