Preview

PDF, German Download (21MB) | Terms of use

Abstract

Zusammenfassung COPI-Vesikel sind für den retrograden Transport von Proteinen und Lipiden vom Golgi-Apparat zurück zum ER und für den bidirektionalen Transport innerhalb des Golgi-Apparates verantwortlich. Die kleine GTPase Arf1 und der heptamere Proteinkomplex Coatomer sind wesentliche Bestandteile der Proteinhülle. In der vorliegenden Arbeit wurden die Lokalisation von Arf1 innerhalb der COPI-Hülle und die Interaktion mit Coatomer näher analysiert. Hierzu wurde ein System verwendet, welches es ermöglicht, die photolabile Aminosäure p-Benzoyl-Lphenylalanin (Bp) an eine definierte Stelle innerhalb eines Proteins einzubauen. Es wurden Arf1-Derivate generiert, bei welchen an zwei unterschiedlichen Stellen jeweils ein Bp eingebaut wurde. Diese Proteine wurden an Golgi-Membranen und an synthetisch hergestellte Liposomen rekrutiert und nach der Zugabe von Coatomer wurde das Bp durch Bestrahlung mit UV-Licht aktiviert. Somit wurde Arf1 kovalent mit möglichen Bindungspartnern, die sich in einer Umgebung von 3 Å befinden, verknüpft. Arf1 I46Bp Y167Bp zeigte eine gleichzeitige GTP-abhängige Interaktion mit den beiden Coatomer-Untereinheiten β- und δ-COP. Die genaue Interaktionsstelle innerhalb von Coatomer konnte nicht ermittelt werden. Anhand von strukturellen Homologien zu dem Clathrin Adaptor-Komplex AP-2 jedoch wird vermutet, dass Arf1 an β- und δ-COP, die aus dem gleichen Coatomer-Komplex stammen, bindet. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Arf1 I49Bp E98Bp nicht nur, wie bereits bekannt war, über die switch I Region (I49) mit γ-COP interagiert, sondern dass auch die „Rückseite“ (E98Bp) von Arf1 eine Bindung mit β-COP eingeht. In diesem Fall handelt es sich um Untereinheiten aus zwei verschiedenen Coatomer-Komplexen, da die Proteine innerhalb eines Komplexes einen zu großen Abstand zueinander aufweisen, als dass Arf1 mit beiden gleichzeitig interagieren kann. Es konnte somit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Arf1 zwei unterschiedliche Coatomer- Komplexe über die Untereinheiten γ- und β-COP miteinander verbrücken kann. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von Arf1 mit Coatomer wurde im Rahmen dieser Arbeit Chaetomium Arf1 kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Dieses thermostabile Protein zeigte in verschiedenen Funktionalitätstests die gleiche Aktivität wie humanes Arf1. Somit kann es für weitere Untersuchungen, wie beispielsweise Ansätze zur Kristallisation von Volllängen-Arf1 im Komplex mit Coatomer eingesetzt werden.