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Abstract

Biomimetic systems and interfaces allow to understand and control cellular behavior in a well defined and reproducible manner. In this study three different strategies are developed to prepare such simplified, well-defined biomimetic materials. Firstly, a combination of click chemistry and gold thiol interactions allows the presentation of two distinct signaling molecules at controlled density and arrangement to investigate the cross-talk between two signaling molecules in cell culture. Secondly, the commonly used Ni2+-NTA interaction with His6- tagged proteins is substantially improved in its stability and inertness for protein immobilization on SAMs by replacing the Ni2+ ions with Co3+ in the complex. Thirdly, His6-tagged proteins are stably tethered on TiO2 nanoparticles for targeted delivery. To produce dual functionalized gold nanostructured interfaces, first the presentation of a ligand of interest with azide functionality on glass substrates at controlled density is established. For this pirpose, alkyne terminated poly(ethylene glycol) (PEG) is covalently bound to glass through a silanization reaction and subsequently modified through copper catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC). The functionalization density can be statistically tuned through the coimmobilization of a methoxy-terminated PEG. The surface coating and its modification with the CuAAC is analyzed using fluorescence microscopy, XPS, an enzymatic digestion assay for the determination of the ligand density, QCM-D and in cell adhesion studies. This PEG coating is used in combination with the established gold nanostructured surfaces to generate orthogonally dual functionalized biomimetic interfaces where one of the ligands is attached to the PEG coating between the gold nanoparticles using the CuAAC and the second ligand is attached to the gold nanoparticles using the gold thiol interaction. These interfaces, which present two distinct ligands at controlled density and arrangement, are suitable to investigate the mutual influence of two signaling molecules on cell behavior. Exemplarily, the combined effect of the adhesion peptide cRGD and the synergy site PHSRN on REF fibroblast adhesion is investigated. While on neither of the monofunctionalized substrates the cells can attach, the cells adhere on the dual functionalized cRGD and PHSRN presenting interfaces. The second part of this study deals with the stable immobilization of His-tagged proteins on NTA presenting surfaces using the cobalt(III) mediated interaction. The cobalt(III) complex is generated by first preforming the well established cobalt(II) complex between NTA and His6-tagged proteins and the subsequent chemical oxidation of Co2+ to Co3+ with hydrogen peroxide. A comparison of the Ni(II) and Co(III) mediated interaction between NTA moieties and His6-GFP reveals the lability of the Ni(II) and stability of the Co(III) complexes against high concentrations of competing ligands and washing off overtime. Further, also the resistance of the Co(III) mediated interaction against reducing agents is demonstrated. The oxidation step in this immobilization strategy can potentially harm the protein’s activity and this has to be investigated case by case. To illustrate that this method can be used to immobilize functional protein, the His6-tagged protein A is immobilized through the Co(III) mediated interaction and it is shown that the oxidation step dosen’t influence the immunoglobulin binding activity. In the third part the Co(III) mediated stable immobilization of His-tagged proteins is used to biofunctionalize TiO2 nanoparticles. Here, the photocatalytic activity of TiO2 is taken advantage of to perform the oxidation of Co(II) complexes between the chelating TETT surface coating on the TiO2 nanoparticles and a His-tagged protein. The Co2+ ion loading capacity of the nanoparticles and their photocatalytic activity is characterized with a colorimetric assay, fluorescence studies using terephtahlic acid as radical detection reagent, absorbance measurements, DLS and zeta potential measurements proving the photo-mediated oxidation of coordinated Co2+ ions to Co3+. Exemplarily, the stable immobilization of the model protein His6-GFP and of the glycoprotein transferrin-His6 is studied.

Translation of abstract (German)

In den vergangenen Jahrzehnten wurden verschiedenste biomimetische Systeme zur Untersuchung grundlegender biologischer Vorgänge, zum Verständnis komplexer Zusammenhänge und zur gezielten Steuerung der Zellantwort entwickelt. Dennoch sind viele Fragestellungen unbeantwortet und der Bedarf an neuartigen biomimetischen Systemen zur Anwendung in der Grundlagenforschung und im biologischen sowie medizinischen Bereich ist ungebrochen. Im Rahmen dieser Studie werden drei unterschiedliche Funktionalisierungstrategien zur Herstellung biomimetischer Substrate verfolgt. Im ersten Abschnitt wird die chemische Modifizierung endständiger Alkingruppen vor dem proteinabweisendem Hintergrund einer Polyethylenglycol (PEG) Monolage mit diversen organischen Aziden durch Kupfer-katalysierte Arid Alkin Cycloaddition (CuAAC) etabliert. Die Funktionalisierungdichte kann dabei je nach Bedarf durch simultane Verwendung eines zweiten PEGs mit endständiger Methoxygruppe angepasst werden. Die Oberflächenbeschichtung wird mittels Fluoreszenzmikroskopie, XPS, einer Analyse der Ligandendichte durch enzymatische Degradierung, QCM-D und einer Zelladhäsionsstudie charakterisiert. Durch Kombination dieses Ansatzes mit einem etabliertem Konzept zur Herstellung hexagonal angeordneter Goldnanopartikel entstehen dual funktionalisierte biomimetische Grenzflächen. Diese ermöglichen die Untersuchung der spezifischenWechselwirkungen von Zellen mit zwei unterschiedlichen Signalmolekülen in definierter Konzentration und Anordnung, wie hier am Beispiel des Einflusses der Adhäsionssequenz RGD und der synergistischen Seite PHSRN auf das Adhäsionsverhalten von Fibroblasten gezeigt. Im zweiten Abschnitt wird die Co(III) Ionen vermittelte stabile Anbindung von His6-markierten Proteinen auf den Chelatliganden NTA präsentierenden Oberflächen abgehandelt. Die vorgeformten Co(II) Komplexe werden durch chemische Oxidation mitWasserstoffperoxid in ihre entsprechenden Cobalt(III) Komplexe überführt. Ein Vergleich der Ni(II) und Co(III) vermittelten Wechselwirkung zwischen dem Chelatliganden und dem Protein offenbart die Labilität des ersteren und die Stabilität des letzteren gegenüber hohen Konzentrationen an konkurrierenden Komplexliganden. Mit Hinblick auf die Reversibilität der Oxidation der Cobaltzentren wird die Beständigkeit gegenüber Reduktionsmitteln untersucht und verifiziert. Ein wichtiger Aspekt ist darüberhinaus die Retention des zu immonbilisierenden Proteins in seiner biologisch aktiven Form. Dies ist besonders vor dem Hintergrund der chemischen Oxidation der Cobaltzentren und der Oxidationsanfälligkeit einiger Proteine zu bewerten.Beispielhaft wird an dieser Stelle dieWechselwirkung von immobilisiertem Protein A mit Immunoglobulin betrachtet. Der dritte Abschnitt der Studie fokussiert die Cobalt(III) vermittelte Anbindung von His-markierten Proteinen auf Titandioxid-Nanopartikeln unter Vorteilsnahme der photokatalytischen Eigenschaften von TiO2 zur Oxidation vorgeformter Cobalt(II) Komplexe. Die Anbindung der His-markierten Proteinen erfolgt durch Co(II) vermittelte Wechselwirkung mit dem auf den TiO2 Nanopartikeln angebundenem Chelator TETT und anschließende Photooxidation der vorgeformten Komplexe. Die Bindungskapazität für Co2+ Ionen und die photokatalytische Aktivität der TiO2 Nanopartikel wird analysiert. Fluoreszenz-, Absorbanz- und Zeta-Potentialmessungen bestätigen die Oxidation oberflächennaher Co(II) Komplexe zu Co(III) durch Bestrahlung der Nanopartikel mit UV Licht. Dieses Konzept wird zur stabilen Anbindung von His-markierten Proteinen auf den TiO2 Nanopartikel verwendet, wie hier exemplarisch für das Modellproteins His6-GFP und das Glycoprotein Transferrin-His6 dargestellt.