German Title: SiRNA Suchtest zur Identifizierung von humanen Kinasen, die den Zusammenbau und die Freisetzung von HIV-1 beeinflussen.

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Abstract

The replication of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is as yet not fully understood. In particular the knowledge of interactions between viral and host cell proteins and the understanding of complete virus-host protein networks are still imprecise. An integral picture of the hijacked cellular machinery is essential for a better comprehension of the virus. And as a prerequisite, new tools are needed for this purpose. To create such a novel tool, a screening platform for host cell factors was established in this work. The screening assay serves as a powerful method to gain insights into virus-host-interactions. It was specifically tailored to addressing the stage of assembly and release of viral particles during the replication cycle of HIV-1. It was designed to be suitable for both RNAi and chemical compound screening. The first phase of this work comprised the setup and optimization of the assay. It was shown, that it was robust and reliable and delivered reproducible results. As a subsequent step, a siRNA library targeting 724 human kinases and accessory proteins was examined. After the evaluation of the complete siRNA library in a primary screen, all primary hits were validated in a second reconfirmation screen using different siRNAs. The purpose of this two-step approach was to identify and exclude false positives. In the end, 43 genes were reconfirmed to influence the assembly and release of HIV-1. Out of those, 39 were host dependency and 4 host restriction factors. Several of them had already been described in the literature to interact with HIV-1. However, various so far unknown host cell proteins were identified within this work. A subsequent combinatory pathway analysis including hits from other published screens identified several important signaling pathways to be important for HIV-1 assembly and release. The described single key proteins and their underlying protein networks provide a basis for the next steps toward understanding the virus and improving treatment in the future.

Translation of abstract (German)

Noch immer gibt es große Lücken im Verständnis der Replikationsmechanik des Humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1). Im Besonderen das Wissen um Interaktionen von HIV-1 mit Wirtszellproteinen ist weiterhin unvollständig, sowie das Wissen über den Aufbau der Virus-Wirt Proteinnetzwerke. Ein umfassendes Bild der, durch das Virus zweckentfremdeten, Zellmaschinerie ist essentiell, um das Virus im Ganzen zu verstehen. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung einer Hochdurchsatz-Screening Plattform als äußerst leistungsfähige Methode, um Einblicke in die Virus-Wirt Wechselbeziehungen zu generieren. Die Plattform ist spezifisch auf die Untersuchung der Partikelbildung und –freisetzung von HIV-1 zugeschnitten. Sie wurde entwickelt, um sowohl mit RNA-Interferenzbibliotheken, als auch mit Bibliotheken chemischer Moleküle verwendbar zu sein. Die erste Phase dieser Arbeit umfasste die Entwicklung und den Aufbau der Plattform unter Durchführung der notwendigen Qualitätstests. Die Ergebnisse zeigten, dass die entwickelte Plattform robust war und verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse lieferte. Als erste Anwendung wurde eine Bibliothek von „short interfering RNAs“ (siRNAs) getestet, die 724 humane Kinasen und verwandte Proteine abdeckte. Zunächst wurde in einem primären Test die komplette Bibliothek untersucht. Um die gefundenen, potenziellen Wirtszellfaktoren zu bestätigen und um mögliche fälschlich-Positive auszusondern, wurden diese Treffer in einem zweiten Bestätigungssuchtest überprüft. Insgesamt wurden hierbei 43 Proteine bestätigt – davon 39 Abhängigkeits- und 4 Restriktionsfaktoren. Einige davon waren schon vorher in der Literatur in Bezug zu HIV-1 beschrieben, jedoch war auch ein Teil in diesem Kontext bisher unbekannt und stellt daher vielversprechende, neue Ziele für das Verständnis von der HIV-1-Replikation dar. Eine anschließend durchgeführte Kombinations-Netzwerk-Analyse unter Einbeziehung anderer Publikationen identifizierte wichtige Signalkaskaden. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse bilden die Basis für zukünftige Untersuchungen, um die spezifischen Rollen dieser Proteine und Netzwerke für die Formation und Freisetzung von HIV-1 aufzudecken.