German Title: Inaktivierung und Aktivierung von Heterochromatin

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Abstract

Repetitive, gene-poor regions termed heterochromatin are typically transcriptionally silent and mostly located at specific chromosomal loci such as (peri)centromeres and telomeres, but are also found interspersed throughout the rest of the genome. Heterochromatin silencing is associated with epigenetic features such as DNA methylation and posttranslational modification of histone tails, e. g. trimethylation of histone 3 lysine 9 (H3K9me3), which is set by the histone methyltransferases SUV39H1 and SUV39H2 among others. However, the mechanisms underlying establishment and stability of repressive histone marks as well as their contribution to transcriptional silencing remain unclear. Here, I show that the SUV39H histone lysine methyltransferases recognize heterochromatin downstream of the methyl-DNA binding protein MECP2 and remain chromatin-bound throughout the cell cycle, linking these enzymes to the specificity and memory of heterochromatin. In addition, SUV39H isoforms displayed distinct non-redundant functions. SUV39H2 contributed more to establishing H3K9me3 than SUV39H1 in mouse embryonic fibroblasts and loss of SUV39H-dependent H3K9me3 was not sufficient for transcriptional derepression. Since tools to resolve the kinetics of transcriptional activation with high spatial and temporal resolution are currently scarce, I devised the Blue Light-Induced Chromatin Recruitment (BLInCR) tool to dissect the activation of the repressed heterochromatin state. I used BLInCR to rapidly and reversibly target the viral transactivator VP16 to an integrated reporter in the U2OS 2-6-3 cell line and to measure the activation kinetics of an initially repressed reporter gene locus. First transcripts were detectable within minutes after triggering the relocalization of VP16 and activation progressed in two phases. Thus, even a strong activator was not able to activate silenced gene clusters in one step. The BLInCR tool introduced here enables the use of complex activation patterns, which will also be valuable to assess the effect of repeated activation and, more generally, to probe the stability of chromatin states to understand the regulation of epigenetic memory. Taken together, these results indicate that only some genes are susceptible to SUV39H- and H3K9me3-mediated repression and that the heterochromatin state can be overwritten by strong, targeted activators. The insights gained within this study on the mechanisms of silencing and activating heterochromatin can help understand heterochromatic deregulation. The latter is frequently observed in disease, e. g. in cancer, and thus, the heterochromatin network might harbor promising targets for epigenetic drug development.

Translation of abstract (German)

Repetitive Teile des Genoms, welche wenige Gene enthalten und in der Regel nicht transkribiert werden, werden als Heterochromatin bezeichnet. Diese Sequenzen befinden sich überwiegend in speziellen Regionen der Chromosomen wie den (Peri-)Zentromeren oder Telomeren, sind aber auch im übrigen Genom vorhanden. Die transkriptionelle Inaktivität des Heterochromatins wird durch epigenetische Faktoren wie DNA-Methylierung und posttranslationale Modifikationen von Histonproteinen gewährleistet. Eine solche Modifikation ist die Trimethylierung von Lysin 9 des Histons 3 (H3K9me3), welche unter anderem durch die Histonmethyltransferasen SUV39H1 und SUV39H2 katalysiert wird. Durch welche Mechanismen repressive Histonmodifikationen etabliert und stabilisiert werden und welche Rolle sie in der transkriptionellen Inaktivierung spielen, ist bisher weitestgehend unklar. In meiner Arbeit zeige ich, dass die Erkennung von Heterochromatinregionen durch SUV39H-Enzyme dem methyl-DNA-bindenden Protein MECP2 untergeordnet ist. Außerdem bleiben sie während des Zellzyklus' an Chromatin gebunden und könnten somit zur Spezifität und Erhaltung von Heterochromatin beitragen. Des Weiteren haben die beiden SUV39H-Isoformen unterschiedliche Funktionen. SUV39H2 trägt in embryonalen Mausfibroblasten mehr zur Trimethylierung von H3K9 bei als SUV39H1 und der Verlust von SUV39H-abhängiger Trimethylierung von H3K9 ist nicht hinreichend für eine transkriptionelle Reaktivierung. Da es derzeit nur wenige Strategien zur Analyse der Kinetik der Transkriptionsaktivierung mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung gibt, habe ich ein Verfahren zur lichtinduzierten Rekrutierung von Effektoren an Chromatin namens BLInCR entwickelt, um die Aktivierung eines inaktivierten Lokus zu untersuchen. Mit BLInCR konnte der virale Aktivator VP16 schnell und reversibel an einen heterochromatischen Reporterlokus in der U2OS 2-6-3-Zelllinie gebunden werden um dessen Aktivierungskinetik zu messen. Die Aktivierung konnte innerhalb weniger Minuten nach der Bindung von VP16 durch RNA-Visualisierung detektiert werden und lief in zwei Phasen ab. Das bedeutet, dass selbst ein starker Aktivator einen inaktivierten Lokus nicht in einem Schritt anschalten konnte. Das hier vorgestellte BLInCR-Verfahren ermöglicht die Anwendung verschiedenster Beleuchtungsmuster, was genutzt werden kann um mehrfach Aktivierung zu initiieren. Im Allgemeinen kann so die Stabilität von Chromatinzuständen geprüft und die Erhaltung von epigenetischen Zuständen untersucht werden. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass nur einige Gene SUV39H- und H3K9me3-vermittelt inaktiviert werden und dass der heterochromatische Zustand durch starke Aktivatoren überschrieben werden kann. Die Erkenntnisse aus dieser Arbeit hinsichtlich der Mechanismen, welche die transkriptionelle Inaktivierung und Reaktivierung von Heterochromatin steuern, können hilfreich sein, um ihre Deregulation zu verstehen. Diese tritt häufig im Krankheitsfall, z. B. bei Krebs, auf und somit könnten im hier untersuchten Heterochromatinnetzwerk Kandidaten zur Entwicklung epigenetischer Medikamente zu finden sein.