German Title: Rezeptor-vermittelte Kräfte für Zell-Matrix-Interaktionen und die Aufnahme von Viruspartikeln

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Abstract

Mechanical forces between cells ensure organic development and homeostasis, but they are also associated with diseases such as cancer or viral infections. The absolute forces in nature can be as high as 1.5 kN, which allows the mantis shrimp to smash oysters, down to a few pN transduced by single cellular receptors. However, these small forces are strong enough for cells to probe their local environment. While the mechanism, which enables cells to investigate the stiffness of their surrounding, is already well elucidated, information on how cells sense spatial distribution of ligands is missing. In this thesis I established a method, which allows to measure cellular traction forces on elastic substrates with varying nano-spacing of extracellular ligands. In contrast to previous studies on stiff substrates, adhesion complexes and tractions were larger for longer distances between extracellular adhesion sites. This can be theoretically explained by the force load on individual integrin receptors, which has to exceed a certain threshold value to promote adhesion growth through conformational changes in a protein of the “clutch complex”. In order to experimentally access the force load per integrin heterodimer, I combined molecular tension fluorescence microscopy (MTFM) with traction force microscopy (TFM). For the first time, I could assess a homogeneous distribution of forces > 19pN underneath the adhesion area of cells on soft substrates. Simultaneously, macroscopic tractions up to 2.7 kPa were observed at the cell edges. Applying stronger tension probes and analyzing tractions in the zdirection will help to cross-validate the results obtained from these two state-of-the-art methods in biomechanics as a next step. In the second part I investigated the mechanical parameters of virus particle uptake by cells. Many intracellular pathogens, such as mammalian reoviruses as employed in this thesis, mimic extracellular motives to interact with host cells and initiate their internalization. This leads to the assumption that host cells sense this specific ligand presentation, engage the endocytic machinery and generate forces, which are able to overcome the bending and tension energy of their plasma membrane. I demonstrated that these forces exerted on single reovirus particles on the basolateral side of cells are strong enough to break down the biotin-NeutrAvidin bond used for virus immobilization on stiff and soft substrates. I quantified the forces to exceed 40pN by kinetic analysis of the tearing of viruses from these surfaces and single MTFM with covalently immobilized reoviruses. The herein presented methods are powerful tools to study forces exerted by individual receptors as well as on single particles e.g. during endocytosis. The involvement of the actin cytoskeleton, specific receptors or molecules of the endocytic machinery was examined. Inhibition of the ligand-receptor interactions between reoviruses and cells did not significantly change the rate of virus uptake. Interestingly, bare nanoparticles of comparable diameter lacking specific binding sites were torn off at a similar rate and thus with the same forces as viruses. Hence, specific receptors seem to be dispensable for virus particle uptake.

Translation of abstract (German)

Mechanische Kräfte zwischen Zellen gewährleisten die Entwicklung von Organen und deren Selbstregulierung, können aber auch zu Krankheiten wie Krebs oder Virusinfektionen führen. Die absoluten Kräfte reichen dabei von 1.5 kPa, was es dem Fangschreckenkrebs ermöglicht Austern zu zerschlagen, bis hinab zu wenigen pN, die von einzelnen zellulären Rezeptoren übertragen werden. Diese sehr geringen Kräfte sind ausreichend für Zellen um ihr lokales Umfeld zu untersuchen. Dabei ist der Mechanismus, welcher es Zellen ermöglicht die Steifigkeit ihrer Umgebung zu ermitteln, bereits gut aufgeklärt. Allerdings fehlen Informationen darüber, wie Zellen die räumliche Verteilung von Liganden wahrnehmen. In dieser Dissertation habe ich eine Methode etabliert, die es erlaubt zelluläre Traktionskräfte auf elastischen Substraten mit verschiedenen Nano-Abständen der extrazellulären Liganden zu messen. Im Gegensatz zu früheren Studien auf steifen Substraten waren die Adhäsionskomplexe und Zugkräfte größer, wenn die Abstände zwischen den extrazellulären Ankerpunkten anstiegen. Dies kann theoretisch durch die Belastungskraft auf einzelne Integrinrezeptoren erklärt werden. Übersteigt sie einen gewissen Schwellenwert, wird das Adhäsionswachstum durch eine Konformationsänderung in einem Protein des “Kupplungs-Komplexes” gefördert. Um die Belastungskraft auf ein Integrin-Heterodimer experimentell zugänglich zu machen, habe ich molekulare Spannungs- Fluoreszenz-Mikroskopie (MTFM) mit Traktionskraft-Mikroskopie (TFM) kombiniert. Dadurch konnte ich zum ersten Mal eine homogene Verteilung von Kräften > 19pN unterhalb der Adhäsionsfläche von Zellen auf weichen Materialien nachweisen. Gleichzeitig wurden makroskopische Zugspannungen bis zu 2.7 kPa an den Zellrändern beobachtet. Stärkere Spannungssonden und Analysen der Zugkräfte in z-Richtung werden im nächsten Schritt eine Kreuzvalidierung dieser modernsten Methoden in der Biomechanik erlauben. Im zweiten Teil habe ich die mechanischen Faktoren der Viruspartikelaufnahme in Zellen untersucht. Viele intrazelluläre Pathogene, wie Reoviren, die in dieser Arbeit verwendet wurden, imitieren extrazelluläre Motive, um mit Wirtszellen zu interagieren und ihre Internalisierung zu initiieren. Dies führt zu der Vermutung, dass Zellen diese spezifische Ligandenpräsentation spüren, die endozytotische Maschinerie herbeiziehen und Kräfte generieren, welche die Biegeund Spannungsenergie der Plasmamembran überwinden können. Ich konnte zeigen, dass die Kräfte, die auf einzelne Reoviren von der basalen Seite von Zellen ausgeübt werden, stark genug sind, um die Biotin-NeutrAvidin Bindung zu brechen, welche für die Immobilisierung der Viren auf harten sowie weichen Materialien genutzt wurde. Mit Hilfe kinetischer Analyse des Abreißens der Viren von der Oberfläche und Einzel-MTFM Messungen mit kovalent immobilisierten Viren ermittelte ich Kräfte, die 40pN überstiegen. Die hier vorgestellten Methoden sind mächtige Werkzeuge zur Untersuchung von Kräften während der Endozytose und der Beteiligung des Aktinzytoskeletts, spezifischer Rezeptoren oder von Molekülen der endozytotischen Maschinerie. Die Hemmung der Rezeptor- Liganden-Interaktion hat die Rate, mit der Reoviren aufgenommen wurden, nicht signifikant geändert. Interessanterweise wurden sogar bloße Nanopartikel mit vergleichbarem Durchmesser aber ohne spezifische Bindestellen mit ähnlicher Rate und somit ähnlichen Kräften wie Viren aufgenommen. Daher scheinen spezifische Rezeptoren für die Virusaufnahme entbehrlich zu sein.