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Abstract

Persistent infections with high-risk human papillomaviruses (hr-HPVs) may cause cervical and other types of cancer. The key event for the transformation of hr-HPV-infected cells into malignant tumor cells is the deregulated expression of the hr-HPV oncogenes E6 and E7. Both gene products interfere with cell cycle checkpoints, inhibit DNA damage repair and induce chromosomal instability. Deregulation of hr-HPV oncogene expression as well as transformation of the host cells are driven by the hypermethylation of specific CpG dinucleotides in the viral and host cellular genome. Thereby, the HPV E2-mediated control of E6 and E7 transcription is disrupted and the expression of host cellular tumor suppressive genes and microRNAs is prevented. Therefore, we hypothesized that the application of demethylating agents might re-establish these regulatory mechanisms reducing the hr-HPV oncogene expression and inhibiting cell proliferation.

To test this hypothesis, the demethylating agent 5-aza-2’-deoxycytidine (DAC) was applied to a panel of six HPV-transformed cell lines. DAC treatment significantly decreased the expression of the HPV oncogenes. As a consequence, the levels of E6 and E7 target proteins, including p53 and p21, increased repressing cell proliferation and colony formation. In addition, the application of DAC strongly induced the expression of tumor suppressive miR-375, which was shown to target and degrade E6 and E7 transcripts. In conclusion, the presented data demonstrate the effectiveness of DAC in the treatment of HPV-transformed cells and suggest its testing in clinical trials.

In addition to the evaluation of treatment strategies, the present thesis aimed to study the effects of HPV oncogene expression on chromosomal stability, gene expression patterns and DNA methylation levels. For this, chromosomally stable HCT116 cells were used as a model system to generate clones allowing the inducible HPV 16 E6 and E7 expression. Immortalization of HCT116 cells, which is characterized by microsatellite instability, can be clearly distinguished from HPV-driven immortalization, which depends on the induction of chromosomal instability. Therefore, HCT116 cells represent an ideal model system to study the HPV 16 oncogene-mediated induction of chromosomal instability.

Induction of HPV 16 oncogene expression affected the chromosomal stability of HCT116 cells by causing abnormal centrosome and spindle pole numbers, by inducing DNA damage and by increasing the number of aneuploid cells. Furthermore, a panel of genes was found to be differentially expressed after induction of HPV 16 oncogene expression potentially representing candidate genes and indicating pathways that might play a role during the transformation of HPV-infected cells. Taken together, HPV 16 oncogene expression seems to increase the genomic variability in the cell population presumably elevating the risk for the generation of highly proliferative subclones over time.

Translation of abstract (German)

Persistierende Infektionen mit humanen Papillomviren der Hochrisiko-Typen (hr-HPVs) können die Entstehung von Zervixkarzinomen und anderen Tumoren hervorrufen. Die maligne Transformation von hr-HPV-infizierten Zellen wird durch eine unkontrollierte Überexpression der Onkogene E6 und E7 ausgelöst, wodurch vor allem der Zellzyklus beschleunigt, DNA Reparaturmechanismen gehemmt und chromosomale Instabilität induziert wird. Die Regulation der Onkogenexpression und die Transformation infizierter Zellen werden maßgeblich durch die verstärkte Methylierung bestimmter CpG Dinukleotide im Virus- und Wirtszellgenom beeinflusst, wodurch die HPV E2-abhängige Kontrolle der HPV Onkogenexpression gestört und die Expression wichtiger tumor-suppressiver Gene und mikroRNAs verhindert wird. Dies lässt vermuten, dass die Anwendung demethylierender Substanzen zur Behandlung HPV-transformierter Zellen die genannten Regulationsmechanismen wiederherstellt und dadurch die HPV Onkogenexpression, sowie die Zellproliferation inhibiert.

Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden in dieser Studie sechs HPV-transformierte Zelllinien mit der demethylierenden Substanz 5-Aza-2'-desoxycytidin (DAC) behandelt. Die Behandlung führte zu einer signifikanten Reduktion der HPV Onkogenexpression, zu einer erhöhten Konzentration der Bindungspartner von E6 und E7, wie beispielsweise p53 und p21, und schließlich zur Hemmung der Zellproliferation. Zusätzlich ließ sich eine starke Expression der tumor-suppressiven miR-375 detektieren, die E6 und E7 Transkripte bindet und deren Abbau auslöst. Die Behandlung von HPV-transformierten Zellen mit der demethylierenden Substanz DAC erscheint somit als ein vielversprechender Ansatz, um die HPV Onkogenexpression und die Proliferation der Zellen zu verhindern.

Neben der Erforschung von Behandlungsstrategien, zielte diese Arbeit darauf ab, den Einfluss der HPV Onkogene auf die chromosomale Stabilität, sowie auf das Genexpressions- und DNA Methylierungsmuster genauer zu untersuchen. Als Modellsystem wurde dafür die chromosomal stabile Zelllinie HCT116 ausgewählt und mittels rekombinanten Kassettenaustauschs zur induzierbaren HPV 16 Onkogenexpression manipuliert. Die Immortalisierung von HCT116 Zellen beruht auf deren Mikrosatelliten-Instabilität und kann daher eindeutig vom HPV-induzierten Transformationsprozess unterschieden werden, der auf einer chromosomalen Instabilität der Wirtszellen basiert. Die Expression der HPV 16 Onkogene bedingte eine Erhöhung des Anteils der Zellen mit abnormalen Centrosomen und der Mitosen mit aberranten Spindelpolen, eine Zunahme von DNA Schädigungen, sowie eine Steigerung aneuploider Zellen und beeinträchtigte somit die chromosomale Stabilität der Zellen. Darüber hinaus wurden nach der HPV 16 E6 und E7 Expression einige differentiell exprimierte Gene identifiziert, die möglicherweise eine Rolle während der Transformation HPV-infizierter Zellen spielen könnten. Die Expression der HPV Onkogene scheint somit die genomische Variabilität der Zellpopulation zu erhöhen, wodurch die Entstehung von stärker proliferierenden Subklonen mit der Zeit gefördert würde.