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Abstract

A fundamental requirement for embryonic development is tight spatiotemporal coordination between a steadily increasing number of cells. A notable example of highly coordinated cellular activity occurs during body axis segmentation of the vertebrate embryo. Organized oscillatory signaling activity produces regular waves of gene expression that traverse the tissue. These oscillations are thought to define the timing of segmentation and the positioning of embryonic segments, the somites. The striking rhythmicity of the process is ascribed to a molecular oscillator in undifferentiated cells, the “segmentation clock”, involving the Notch, Wnt and FGF signaling pathways in mouse. While the segmentation clock and its intercellular coordination mechanism have been studied in some detail, the start of the process, the establishment of an initial synchrony between several hundreds of presomitic cells, remains largely unknown. I chose a live imaging approach to examine the onset of synchronous signaling oscillations in the developing embryo. To this end, I established a mounting and culture method to enable long-term multi-sample post-implantation mouse embryo imaging on a light-sheet microscope. This new setup enables routine embryo culture and imaging from early gastrulation on embryonic day 6.5 for up to two days, closely recapitulating in utero development. Using genetically encoded signaling reporters to visualize the cellular oscillation status, I was able to capture the very first observable coherent oscillations of the cyclic gene Lfng as well as the preceding dynamics. I found concurrent upregulation of Lfng expression across nascent mesoderm and the primitive streak at mid gastrulation, marking the first synchronous activity pattern of this segmentation clock gene. This expression pulse was also seen for the FGF signaling target Dusp4 but not the Wnt target Axin2. Despite Lfng being a Notch signaling target in the context of somitogenesis, I found the Lfng pulse to occur in the presence of Notch signaling inhibitor DAPT as well as in the absence of Notch transcription factor RBP-J κ and the Notch signaling core oscillator HES7. These findings argue for an initial synchronization signal independent of the Notch pathway. Quantification of early wave dynamics identified a gradual buildup of phase waves and revealed that a period gradient, which is present from the very first observable oscillation onwards, functionally underlies the establishment of waves in the gastrulating embryo. Taken together, this study provides detailed and quantitative insight into the dynamics of the early segmentation clock in the mouse embryo, pioneering future studies on the molecular mechanism of the synchronization process. The post-implantation embryo culture and imaging method described here opens up new possibilities for the study of the gastrulation-to-organogenesis stages, which in the past have been difficult to follow in real time. Further technical developments of multi-sample mammalian embryo microscopy, which I also discuss in this work, will continue to make an important contribution to the investigation of the establishment of the segmentation clock, and beyond can help to better understand many aspects of mammalian embryonic development.

Translation of abstract (German)

Für die erfolgreiche Entwicklung eines Embryos ist die Koordination einzelner Zellen im Kontext des Gesamtorganismus entscheidend. Ein eindrückliches Beispiel dafür liefert die Somitogenese bei Vertebraten. Dieser entwicklungsbiologische Prozess, bei dem die Körperachse eines Embryos in einzelne Segmente gegliedert wird, ist von gleichmäßigen Genexpressionswellen begleitet. Diese wandern durch das undifferenzierte Gewebe und sind für die Positionierung von Segmenten und für den zeitlichen Ablauf der Somitogenese verantwortlich. Als Taktgeber dieses äußerst rhythmischen Vorgangs fungiert auf zellulärer Ebene ein Netzwerk molekularer Oszillatoren, die „Segmentierungsuhr“. In der Maus ist dieses Netzwerk sowohl aus Komponenten des Notch-, als auch des Wnt- und FGF-Signalwegs aufgebaut. Eine Reihe von Studien hat sich bereits mit der zellulären Segmentierungsuhr, sowie mit dem interzellulären Kommunikationsmechanismus befasst. Wenig ist allerdings darüber bekannt, wie hunderte von Zellen zu Beginn des Segmentierungsprozesses ihre Genexpression synchronisieren und die ersten Oszillationen initiieren. Um dieser Frage auf den Grund zu gehen, habe ich eine Methode entwickelt, die es erlaubt Mausembryonen nach der Nidation für längere Zeit bei weitgehend ungestörter Entwicklung zu mikroskopieren. Dazu habe ich die Kulturbedingungen und die Probenaufhängung an einem Lichtblattmikroskop auf die Bedürfnisse der Embryonen angepasst. Die Methode gestattet nun eine zuverlässige Observation von Embryonen beginnend von Tag 6.5 der Embryonalentwicklung über die Dauer von bis zu zwei Tagen. Mit genetisch kodierten Fluoreszenzreportern, die es ermöglichen die Signalisierungsaktivitäten der Zellen zu visualisieren, konnte ich die ersten erkennbaren Oszillationen des zyklisch exprimierten Gens Lfng, wie auch die dynamische Entwicklung vor dieser ersten Welle im lebenden Embryo beobachten. Zu den wichtigsten Erkenntnissen dieser Studie zählt die Entdeckung des ersten synchronen Expressionsmusters von Lfng vor der ersten Welle: Zellen des neu gebildeten Mesoderms und des Primitivstreifens erhöhen gleichzeitig ihre Expressionsaktivität in einer Art Puls, welcher auch im Expressionsprofil von Dusp4, einem Zielgen des FGF-Signalwegs, zu sehen ist. Im Gegensatz dazu zeigt Axin2, Teil der Wnt-Signalkette, keine vergleichbare Dynamik. Obwohl Lfng während der Somitogenese durch den Notch-Signalweg kontrolliert wird, stellte sich heraus, dass der Puls auch dann auftrat, wenn der Signalweg durch die Gabe des Inhibitors DAPT blockiert wurde. Auch die genetische Unterbrechung der Notch-Signalkette durch Ausschalten des Transkriptionsfaktors Rbp-jκ, sowie des Hes7-Gens, welches für die Generierung der Oszillationen verantwortlich gemacht wird, hatte keinen offensichtlichen Einfluss auf den Lfng-Puls. In der Summe legen diese Resultate daher nahe, dass die initiale Synchronisation einzelner Zellen im Mausembryo unabhängig von Notch-Signalen abläuft. Weiterhin konnte durch quantitative Analyse der Wellendynamik der graduelle Aufbau von Phasenwellen beschrieben werden. Als Grund für die Entstehung von Wellen konnte ein Periodengradient identifiziert werden, der bereits mit der ersten erkennbaren Welle auftrat. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die hier vorliegende Studie einen detaillierten Einblick in die Dynamiken um den Start der Segmentierungsuhr gewährt und somit den Grundstein für weitergehende Forschung zu diesem Thema legt. Die hier vorgestellte Technik zur Langzeitmikroskopie von Mausembryonen eröffnet neue Möglichkeiten zur detaillierten Studie entwicklungsbiologischer Aspekte im bisher für Lebendmikroskopie wenig zugänglichen Zeitraum der Gastrulation. Technische Weiterentwicklungen der Embryonenmikroskopie, wie ich sie ebenfalls in dieser Arbeit beschreibe, werden sowohl zum Thema der Etablierung der Segmentierungsuhr als auch darüber hinaus einen wichtigen Beitrag zu unserm Verständnis der Säugetierembryonalentwicklung leisten.