German Title: Die Kombination von Prox1 / NeuroD1-Transkriptionsfaktor-Überexpression steigert die Bildung von Dentat-Gyrus-Granulen-Neuronen aus pluripotenten Stammzellen

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Abstract

ESCs haben die Fähigkeit unbegrenzter Selbsterneuerung und Pluripotenz. Es sind vielversprechende Werkzeuge, die von der Grundlagenforschung in der Entwicklungsbiologie bis zu zukünftigen therapeutischen Ansätze reichen. Nach der Etablierung grundlegender Techniken für die Kultivierung und neuronalen Differenzierung der ESC war das Hauptanliegen dieser Arbeit die Differenzierung in spezifische Neuronen des Telencephalons. Und zwar bestand unser Ziel darin, die Differenzierung der ESCs auf die Körnerzellen des Gyrus dentatus auszurichten. Bislang wurden zwei wichtige Arbeiten über die Hippocampus-Induktion von ES- und IPS-Zellen publiziert (Yu, Di Giorgio et al. 2014) (Sakaguchi, Kadoshima et al. 2015). Beide Methoden basieren auf der Rolle der Wachstumsfaktoren in Bezug auf die Hippocampus-Entwicklung. Zu Beginn der Arbeit wurden sowohl die Online-Plattformen GenePaint und Allen Brain Atlas als auch frühere Studien bezüglich zellulärer Lokalisation von Wachstums- und Transkriptions-Faktoren studiert. Daraus ergab sich die Fragestellung, welche der Wachstumsfaktor- Kombinationen einen größeren Einfluss auf die Differenzierung der Körnerzellen des Gyrus dentatus aus mESCs haben. Der Wachstumsfaktor-Cocktail mit DKK1 zeigte eine ausgeprägtere Induktion der neuronalen Progenitor-Zellen im Telencephalon. Zudem bewirkte dieser eine stärkere Generierung von Kolonien hochangereicherter Gyrus dentatus-Zellen. Diese zeigen Ähnlichkeit mit Progenitor-Zellen und exprimieren die Gyrus dentatus-Marker Prox1, Neurod1 und Emx1. Im nächsten Teil wurde die Rolle der Transkriptionsfaktoren Emx2, Prox1 und NeuroD1 im Hinblick auf Produktion und Induktion von Körnerzellen des Gyrus dentatus jeweils separat untersucht. Eine hohe Expression von Emx2 unterdrückt die Differenzierung von telencephalen neuronalen Progenitor-Zellen in Körnerzellen. Eine Überexprimierung von NeuroD1 und Prox1 hingegen führen zu einer starken Hochregulierung hippocampaler Progenitor–Marker. Die stärkste Differenzierung in Körnerzellen wurde mit einer kombinierten Überexpression von PROX1 und NEUROD1 erreicht. Morphologische Beobachtungen zeigen deutlich einen signifikanten Anstieg der Neurogenese. Dies zeigt sich ebenfalls im Vergleich zu anderen Gruppen. Der Vergleich zwischen den Differenzierungs-Effekten von Wachstums- und Transkriptionsfaktoren zeigt, dass die Wachstumsfaktoren eine stärkere Induktion von Neuro-Progenitorzellen als Transkriptionsfaktoren herbeiführen. Im Gegensatz dazu führen die Transkriptionsfaktoren, und insbesondere die Kombination von Prox1 und Neurod1, zu einer Ausbildung des neuronalen Phänotyps der Zellen. Aus all diesen Beobachtungen ergibt sich Folgendes: Die Kombination von zentralen Transkriptionsfaktoren des Gyrus dentatus beeinflussen hauptsächlich die Differenzierung in Körnerzellen in vitro. Weiter zeigte sich, dass ein Gyrus dentatus spezifischer Wachstumsfaktor-Cocktail und Transkriptionsfaktoren zu einer effektiveren Differenzierung der Granula Neurone des Gyrus dentatus führen.

Translation of abstract (English)

ESCs have the capacity of unlimited self-renewal and pluripotency, which are promising tools ranging from basic research in developmental biology to future therapeutic applications. Following the establishment of basic techniques for ESC cultivation and neuronal differentiation, the main objective was to direct the differentiation towards specific types of neurons. For instance, our goal was to direct the differentiation of ESCs towards the DG granule neurons. So far, two major reports have been published in regard to the hippocampal induction from ESC and IPS cells (Yu, Di Giorgio et al. 2014); (Sakaguchi, Kadoshima et al. 2015). Both strategies are based on the role of growth factors related to the hippocampus development. Initially, the online platforms GenePaint.org and Allen Brain Atlas as well as previous studies dealing with the cellular localization of both growth factors and transcription factors in the DG and molecular mechanisms contributing to DG differentiation were used as underlying scenario. Resulting from that the question arised which growth factor combination would be of stronger influence to the differentiation into DG granule neurons from mESCs. The growth factor cocktail with DKK1 has proven to be more inductive in telencephalic neuronal progenitor cells and also more prone to the generation of highly enriched mouse DG progenitor-like colonies - which expressed DG markers such as Prox1, Neurod1 and Tbr2. In the next part, the role of the transcription factors Emx2, Prox1 and NeuroD1 in the production and induction of DG granule neurons was investigated. A high expression of Emx2 suppresses the differentiation of telencephalic neuronal progenitor cells to DG progenitor cells and DG granule neurons, while NeuroD1 and Prox1 overexpression lead to a strong up-regulation of hippocampal progenitor markers. The strongest granule cell differentiation expression profile was reached with the combined overexpression of PROX1 and NEUROD1. Morphological observations clearly demonstrate a considerable increase in neurogenesis. This phenomenon can be seen in other groups as well. A comparison of the growth factor effects with those of the transcription factors do show that the growth factors will lead to an increase in the induction of neuro-progenitor cells. By contrast, the transcription factors, and especially the combined prox1 and neurod1, pushed the cells to neuronal phenotype. In summary, it can be concluded that the combination of central DG transcription factors mainly influences DG granule neuron differentiation in vitro. Furthermore, it became obvious that the combination of a DG specific growth factor cocktail and transcription factors will lead to a significant differentiation of DG granule neurons.