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Abstract

Rationale: Bluthochdruck-assoziierte Herz- und Kreislauferkrankungen bilden weltweit die häufigste Todesursache. Besonders vaskulären, pathophysiologischen Zuständen geht oft ein arterieller Gefäßwandumbau voraus. Maßgeblich an diesem Umbau beteiligt sind glatte Gefäßmuskelzellen (GMZ). Diese erhalten im arteriellen System durch Kontraktion den myogenen Tonus aufrecht. Verändert sich das arterielle System pathologisch, beginnen GMZ zu proliferieren, zu migrieren und Matrixbestandteile freizusetzen. Die Fähigkeit dieser Zellen, ihre Funktion an die umgebende Situation anzupassen, wird Phänotypwechsel genannt. Sobald eine Zelle beginnt sich zu teilen oder zu migrieren, hat sie den synthetischen Phänotyp angenommen. Die Expression von Genprodukten des kontraktilen Apparates (z.B. smooth muscle-myosin heavy chain (SM-MHC) und Calponin) markiert dagegen ihren kontraktilen Phänotyp. Diese biologische Plastizität wird durch aktivierte G-Protein-Rezeptoren mitbestimmt, die gekoppelt sind an unterschiedliche Gα-Untereinheiten wie Gαs, Gα12/13, Gαq/11 und Gαi/o. Die beschleunigte Terminierung aktiver Gα-Untereinheiten erfolgt durch regulators of g-protein signaling (RGS) Proteine. RGS5 kann in GMZ in der Funktion als GTPase-activating protein (GAP) die Terminierung der Aktivität der Untereinheiten Gαq/11 und Gαi/o beschleunigen. Im arteriellen System kommt RGS5 eine besondere Bedeutung zu. Über die Involvierung von RGS5 in unterschiedliche pathologische Zusammenhänge wie Arteriogenese, Bluthochdruck und Neointimabildung wurde bereits berichtet. Die grundlegende Wirkung von RGS5 auf den Phänotypwechsel von GMZ, unabhängig von Umbauprozessen, wurde allerdings noch nicht untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst der grundlegende Einfluss von RGS5 auf den Phänotyp kultivierter, synthetisch aktiver GMZ untersucht werden. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob der Gαq/11- und/oder Gαi/o-abhängige Signalweg die beobachteten Veränderungen bedingen könnte. In einem weiteren Ansatz sollten kultivierte GMZ biomechanisch gedehnt werden, um zu untersuchen, ob RGS5 einen Einfluss auf die Dehnungsantwort dieser Zellen hat. Zudem sollte eine transgene Maus generiert werden, die RGS5 ausschließlich in GMZ überexprimiert, um in einem späteren Ansatz die Relevanz der in vitro-Ergebnisse durch in vivo-Versuche zu überprüfen. Methoden und Ergebnisse: (I) Anhand einer Transkriptomanalyse konnte unter Adenovirus-Vektor-induzierter RGS5-Überexpression die reduzierte Expression zellzyklusabhängiger Gene erfasst werden. Eine reduzierte Anzahl sich teilender Zellkerne nach RGS5-Überexpression bestätigte eine Einschränkung der Zellteilung. Neben der Proliferation ist auch die Migration ein Merkmal des Phänotypwechsels. Im Rahmen von Migrationsuntersuchungen konnte dazu eine Hemmung der Migration der GMZ nach RGS5-Überexpression beobachtet werden. Ferner konnte nach RGS5-Überexpression ein Calponin-Anstieg in kultivierten GMZ dokumentiert werden. Um die Spezifität RGS5-vermittelter Effekte auf den Phänotyp kultivierter GMZ beurteilen zu können, wurde RGS16, das im Vergleich zu RGS5 eine schwächere Inhibition der Gαi/o-Aktivität bewirkt, ebenfalls überexprimiert und bezüglich seiner Wirkung untersucht. Eine Überexpression von RGS16 zeigte dabei lediglich in Proliferationsuntersuchungen einen signifikanten RGS5-ähnlichen Effekt. Die Erfassung von möglichen, ebenfalls an den beobachteten Effekten beteiligten Signalmolekülen erfolgte zunächst mit Hilfe eines Proteinkinasenaktivitäts-Arrays. Dabei zeigte sich nach RGS5-Überexpression eine reduzierte Phosphorylierung der MAP-Kinase ERK1/2. Im Rahmen dieser Arbeit ahmte ausschließlich die Inhibition der Aktivität der Gαi/o-Untereinheit und damit die Aktivierung der Adenylatzyklase durch deren Stimulator Forskolin die Effekte von RGS5 auf die Phosphorylierung von ERK1/2, die Proliferation und Migration nach. (II und III) Nach RGS5-Überexpression konnte in GMZ ein Anstieg der RhoA-Aktivität beobachtet werden. RhoA ist wiederum bei der Dehnungsantwort und damit u.a. an dem Phänotypwechsel dieser Zellen beteiligt. In gedehnten GMZ wurde gleichzeitig ein Anstieg der RGS5-Menge beobachtet. Um nun zu überprüfen, ob das erhöhte RGS5-Vorkommen die Dehnungsantwort dieser Zellen beeinflusst, wurde eine weitere Transkriptomanalyse durchgeführt. Nach biomechanischer Dehnung der GMZ, die RGS5 überexprimieren, konnte dabei ein Anstieg in der Expression der Gene mki67 und cdk1, deren Genprodukte die Zellteilung anzeigen, festgestellt werden. Gleichzeitig stieg die Genexpression typischer dehnungsassoziierter Marker wie Interleukin-8 und Interleukin-33 an. (IV) Die Generierung einer transgenen Maus sollte es ermöglichen eine RGS5-Überexpression ausschließlich in GMZ einzuleiten. Damit sollte die Relevanz der in vitro-Effekte von RGS5 in vivo untersucht werden. Initiale Versuche zeigten eine erfolgreiche Induktion der mRNA-Expression von RGS5 in Gefäßen und GMZ nach Tamoxifen-Induktion der Cre-Rekombinase-Expression bzw. Cre Rekombinase-Behandlung. Zusammenfassung: Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen im in vitro-Kontext (I) eine Redifferenzierung des in vitro bereits synthetisch aktiven Phänotyps von GMZ zum kontraktilen Phänotyp durch RGS5-Überexpression. Zusätzlich weisen die Daten für RGS5 (II) auf eine mögliche Rolle als Dehnungssensibilisator in GMZ hin. Des Weiteren lassen diese Befunde (III) eine kontext-gebundene Wirkweise für RGS5 in GMZ vermuten. Mit der Generierung der transgenen Maus (IV), die RGS5 glattmuskelzellspezifisch und induzierbar verstärkt exprimiert, konnte der Grundstein gelegt werden für in vivo-Untersuchungen der RGS5-Funktion im pathophysiologischen Kontext.

Translation of abstract (English)

Rationale: Blood pressure-associated cardiovascular diseases still remain one of the most frequent causes of mortality and morbidity worldwide. These pathological conditions are accompanied by arterial remodelling processes of the vessel wall with a predominant vascular smooth muscle cell (SMC) contribution. While vascular SMCs maintain the myogenic tone by contraction in a healthy environment, pathophysiological changes in the arterial system lead to reduced contractility of SMCs and yet increased proliferation, migration as well as production and secretion of matrix proteins. The ability of vascular SMCs to adapt their function to environmental changes is referred to as the “phenotypic switch”. i.e. a shift from the quiescent contractile to the juvenile so called “synthetic phenotype” as soon as the cells start to proliferate and exhibit an enhanced migratory capacity. Vascular SMC contraction and the expression of gene products of the contractile apparatus such as smooth muscle myosin heavy chain (SM-MHC) and calponin, however, constitute what is known as the “contractile phenotype”. This biological plasticity is highly regulated by G-protein-receptor (GPCR)-depending signaling pathways, coupled to Gα-subunits like Gαs, Gα12/13, Gαq/11 und Gαi/o. Regulators of G-protein signaling (RGS) proteins accelerate inactivation of these subunits, therefore terminating intracellular signaling based on GPCR-activation. In a healthy cardiovascular system, RGS5 terminates the activity of the subunits Gαq/11 and Gαi/o by acting as a GTPase-activating protein (GAP). In the pathological context of arterial remodelling processes, RGS5 has been implicated in a number of pathological conditions including hypertension, arteriogenesis and neointima formation. Only little is known about its basic function in vascular SMCs besides pathophysiologic remodelling processes. Likewise, the mechanisms inducing the phenotype change of vascular SMCs still remain unclear. Therefore, the aim of this work was to analyse the fundamental effects of RGS5 on SMC plasticity. The detailed scope of this work consisted of investigating basic effects of RGS5 on the phenotype of cultured, synthetic arterial SMCs. In addition, it was of interest to investigate whether active Gαq/11- and/or Gαi/o-based signaling drive the observed effects. Furthermore, cultured arterial SMCs were cyclically stretched to examine the effect of RGS5-overexpression on their response of SMCs to deformation as it occurs, e.g. in arterial hypertension. Additionally, a SMC specific, RGS5 overexpressing transgenic mouse model was generated which may be utilized in the near future to further validate the relevance of the in vitro findings in an in vivo setup. Methods and Results: (I) Microarray-based transcriptome analysis revealed a reduction in gene expression of cell cycle markers in cultured, synthetic arterial smooth muscle cells upon RGS5 overexpression. A reduction in the number of Ki-67-positive arterial SMCs following RGS5overexpression corroborated the microarray data suggesting reduced proliferation. Given that enhanced migration of vascular SMCs is indicative of the synthetic phenotype, spheroid-based migration studies were utilized to investigate whether RGS5 overexpession reduces the migratory properties of these cells. Subsequently, cells showed an increase in calponin abundance. Moreover, to define the unique functions of RGS5, a comparative analysis was carried out for another RGS protein, RGS16. RGS16 has a weaker effect on the activity of the Gαi/o subunit as compared to RGS5 and only the inhibitory effect on vascular SMC proliferation upon RGS16 overexpression was comparable to that observed upon overexpression of RGS5. For further investigation on the underlying mechanism of RGS5 signaling in SMCs the phosphorylation hence activation pattern of a broad range of protein kinases was analysed by using a commercial profiler array. The results revealed reduced phosphorylation of the MAP kinase ERK1/2 upon RGS5 overexpression. Increased activity of adenylate cyclase using forskolin also mimicked the effects of RGS5 on proliferation and migration of the vascular SMCs and repressed ERK1/2 phosphorylation. (II and III) SMCs revealed an increase in the amount of GTP-bound RhoA immediately after RGS5 overexpression. Active RhoA is a stretch sensitizer and a key modulator of vascular SMC plasticity during arterial remodelling processes. At the same time, stretched SMCs revealed increased levels of RGS5. To investigate whether RGS5 is involved in the stretch response of the vascular SMCs, a microarray-based transcriptome analyses was carried out with stretched and static control SMCs. This revealed an increase in gene expression of cell cycle markers in the vascular SMCs overexpressing RGS5. At the same time, expression of genes coding for stretch-associated marker proteins like interleukin-8 and interleukin-33 was upregulated. (IV) The generation of a transgenic mouse further enabled additional and inducible expression of RGS5 exclusively in vascular SMCs. Initial experiments validated an increase in RGS5 mRNA expression in blood vessels of the transgenic animals after tamoxifen induction of Cre recombinase expression and in vascular SMCs isolated from these animals when subjected to exogenous Cre recombinase treatment. Conclusion: The results of this work indicate (I) a phenotype shift of “synthetic” vascular SMCs towards the quiescent, “contractile” phenotype upon RGS5 overexpression in vitro. At the same time, (II) an increase in stretch-associated gene expression and reversed gene expression of cell cycle markers upon stretch exposure point towards a role for RGS5 as a stretch sensitizer. Furthermore, these changes upon stretch induction reveal (III) a context-dependent function for RGS5 in vascular SMCs. On the other hand, these findings highlight the need to investigate the functional role of RGS5 in vivo. (IV) The specific transgenic mouse model of a conditional and cell-specific overexpression of RGS5 in vascular SMCs generated hereein will serve as a corner stone for future investigations into the functional role of RGS5 in pathophysiological settings.