German Title: Funktionelle Charakterisierung des Plasmodium berghei Ferlin-like Proteins

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Abstract

Proteins of the ferlin family mediate calcium-dependent vesicular fusion. Although present throughout eukaryotic evolution, their function in unicellular organisms including apicomplexan parasites is unknown. This study defined for the first time a crucial role for a ferlin-like protein (FLP) in host-to-vector transmission of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Analysis of flp expression profile revealed a peak in the gametocyte stage. Endogenous tagging of the protein confirmed high abundance of FLP in this stage. In agreement with the reported vesicular localization of ferlins, HA-tagged FLP labelled intracellular speckles in asexual and sexual blood stages. The FLP-labelled vesicles relocalized to the cell periphery during gamete maturation, suggesting that they might act in the process of the gamete egress from the red blood cell. Infection of the mosquito vectors requires the formation of free gametes and their fertilization in the mosquito midgut. Mature gametes will only emerge upon secretion of factors that stimulate the disruption of the red blood cell membrane and the parasitophorous vacuole membrane. Lysis of the surrounding membranes is a critical step in host-to-vector transmission and its failure prevents infection of the mosquito. Genetic depletion of FLP in sexual stages led to a complete life cycle arrest in the mosquito. Although mature gametes formed normally, mutants lacking FLP remained trapped in the red blood cell. FLP function was restricted to egress as the observed phenotype was rescued by detergent-mediated in vitro membrane lysis facilitating escape from the host cell and allowing normal life cycle progression of the FLP-depleted gametocytes. The data of this work define FLP as a novel critical factor for Plasmodium fertilization and transmission and suggest an evolutionarily conserved example of ferlin-mediated exocytosis.

Translation of abstract (German)

Proteine aus der Familie der Ferline vermitteln die Calcium-abhängige Fusion zellulärer Vesikel. Obwohl Ferline in der eukaryotischen Evolution konserviert sind, ist ihre Funktion in einzelligen Organismen, die Parasiten der Apicomplexa inbegriffen, bislang unbekannt. In dieser Studie wird erstmals die entscheidende Rolle eines Ferlin-ähnlichen Proteins (FLP, Ferlin-like protein) für die Übertragung des Nagetiermalariaerregers Plasmodium berghei vom Wirt auf den Moskitovektor beschrieben. Die Analyse des FLP-Expressionsprofils zeigte ein Maximum im Gametozytenstadium. Die endogene Markierung (tagging) des Proteins bestätigte die starke Anreicherung in diesem Parasitenstadium. In Übereinstimmung mit der bekannten vesikulären Lokalisation von Ferlinen, konnte Hämagglutinin (HA)-markiertes FLP in punktförmigen Bereichen innerhalb asexueller und sexueller Blutstadien visualisiert werden. Während der Gametogenese kam es zu einer Relokalisierung der Vesikel an der Zellperipherie, was einen Hinweis darauf lieferte, dass diese am Prozess des Austritts der Gameten aus dem Erythrozyten beteiligt sein könnten. Die Infektion des Moskitovektors ist abhängig von der Bildung freier Gameten und deren Fertilisation im Mitteldarm der Stechmücke. Nur durch die Sekretion von Faktoren, die zur Auflösung der parasitophoren Vakuolen- und Erythrozytenmembran führen, können reife Gameten entstehen. Die Lyse dieser umhüllenden Membranen stellt einen essentiellen Schritt bei der Übertragung vom Wirt auf den Vektor dar. Ein Ausbleiben dieser Membranlyse verhindert die erfolgreiche Infektion der Stechmücke. Die genetische Depletion von FLP in Sexualstadien führte zu einer vollständigen Unterbrechung des Lebenszyklus in der Stechmücke. Obwohl sich reife Gametozyten normal ausbildeten, blieben mutierte Parasiten ohne FLP im Erythrozyten eingeschlossen. Die Funktion von FLP konnte auf den Austritt der Gameten eingegrenzt werden, da der beobachtete Phänotyp durch eine in vitro Membranlyse unter Verwendung eines Detergenz rückgängig gemacht werden konnte. Dies ermöglichte den Austritt aus der Wirtszelle und resultierte folglich in einer normalen Weiterentwicklung FLP-depletierter Gametozyten. Die Ergebnisse dieser Arbeit definieren FLP als einen neuen und entscheidenden Faktor bei der Fertilisation und Übertragung von Plasmodium und weisen auf ein evolutionär konserviertes Beispiel Ferlin-vermittelter Exozytose hin.