English Title: Identification and characterization of a novel RanGTP-binding protein in the yeast Saccharomyces cerevisiae

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Abstract

Der kleinen GTPase Ran kommt in interphasischen Zellen eine zentrale Rolle beim Transport von Molekülen durch die Kernmembran zu.In höheren eukary- ontischen Zellen zerfällt während der Prometaphase der Mitose die Kern- membran.Es konnte neuerdings gezeigt werden,daß Ran auch in mitotischen Zellen eine wichtige regulatorische Funktion,nämlich bei der Ausbildung von Spindeln sowie in der Telophase bei der Neubildung der Kernmembran,über- nimmt.Ob Ran auch in einfachen Eukaryonten weiter direkte Funktionen ausübt, ist bislang unklar. Um neue Bindungspartner von Ran in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae zu identifizieren,wurde eine Zwei-Hybrid-Durchmusterung des Hefegenoms unter Verwendung des Hefehomologen von Ran,Gsp1p,als Beute durchgeführt. Dabei konnte ein bislang uncharakterisiertes Protein (Yrb30p),kodiert durch den ORF YGL164C,als neues mit Ran interagierendes Protein identifiziert werden. Dieses nichtessentielle Protein interagiert spezifisch mit der GTP-gebundenen Form von Ran,weist jedoch keinerlei Sequenzähnlichkeiten mit anderen RanGTP-bindenden Proteinen auf.Es konkurriert mit dem Ran-bindenden Protein Hefe-RanBP1 (Yrb1p)um die Bindung an RanGTP und besitzt wie Yrb1p die Fähigkeit mit RanGTP und einigen Karyopherinen trimere Komplexe zu bilden.Im Gegensatz zu Yrb1p,welches als Koaktivator der RanGAP1(Rna1)- vermittelten GTP-Hydrolyse von Ran fungiert,inhibiert Yrb30p die Hydrolyse und ist in dieser Hinsicht den Karyopherinen ähnlich.Obwohl das Protein unter Normalbedingungen im Zytoplasma lokalisiert,konnte eine funktionelle nukleäre Export-Sequenz (NES)im C-Terminus von Yrb30p nachgewiesen werden.Die Lokalisation verschiedener Mutanten weist darauf hin,daß Yrb30p zwischen Kern und Zytoplasma hin-und herpendelt und neben einem Xpo1-abhängigen Export noch ein alternativer Exportweg existiert. Weder die Überproduktion des Proteins noch die Deletion des YRB30 ORFs führt alleine bzw.in Kombination mit verschiedenen Mutanten des RanGTPase-Zyklus zu einem erkennbaren Wachstumsdefekt.Diese Resultate sowie die Tatsache, daß Homologe nur in anderen Pilzen identifiziert werden konnten,deuten darauf hin,daß Yrb30p ein Modulator des RanGTPase-Zyklus ist,der möglicherweise auf das Pilzreich beschränkt ist.

Translation of abstract (English)

The small Ras-like GTPase Ran plays an essential role in the transport of macromolecules in and out of the nucleus and has been implicated in spindle and nuclear envelope formation during mitosis in higher eukaryotes.We identified S. cerevisiae ORF YGL164c encoding a novel RanGTP-binding protein,termed Yrb30p. The protein competes with yeast RanBP1 (Yrb1p) for binding to the GTP-bound form of yeast Ran (Gsp1p)and is,like Yrb1p,able to form trimeric complexes with RanGTP and some of the karyopherins.In contrast to Yrb1p,Yrb30p does not coactivate but inhibits RanGAP1(Rna1p)-mediated GTP-hydrolysis on Ran,like the karyopherins.At steady state,Yrb30p localizes exclusively to the cytoplasm,but the presence of a functional nuclear export signal (NES) and the localization of truncated forms of Yrb30p suggest that the protein shuttles between nucleus and cytoplasm and is exported via two alternative pathways,dependent on the nuclear export receptor Xpo1p/Crm1p and on RanGTP-binding. Overproduction of the full-length protein and complete deletion of the ORF reveal no obvious phenotype, nor alone or in combination with different mutants of the RanGTPase cycle. Based on these results and the exclusive conservation of the protein in the fungal kingdom,we hypothesize that Yrb30p represents a novel modulator of the Ran GTPase switch related to fungal lifestyle.