English Title: The LC-1-locus in the mouse-genome: a suitable site for the tight regulation of "transgenes" via teracycline ?

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Abstract

Systeme zur stringenten Kontrolle der Genexpression sind zur Analyse von Genfunktionen in Säugerzellen und in Modellorganismen von großer Bedeutung. Hier hat sich in den letzten Jahren vor allem das in unserem Labor entwickelte Tet-System durchgesetzt, das auf den Kontrollelementen des Tetrazyklin-Resistenzoperons des Tn10 aus E. coli basiert und die Transkription von Genen mittels Doxyzyklin (Dox) zu kontrollieren erlaubt. Ein zentrales Element in diesem System ist Ptet, ein artifizieller Promotor, der aus einem RNA Polymerase II-Minimalpromotor und einer Reihe von tet-Operator-Sequenzen besteht. Dieser Promotor wird durch ebenfalls artifizielle Transkriptionsaktivatoren (tTA/rtTA) aktiviert, die Dox-abhängig an die tet-Operatoren binden. Durch die zufällige Integration der Ptet-kontrollierten Transkriptionseinheiten bei der Herstellung von transgenen Mauslinien zur konditionalen Genexpression unterliegen die Konstrukte dem Einfluss der genomischen Sequenzen am Integrationsort. Dies führt in nur 5-10% der Fälle zu Linien mit guten Regulationseigenschaften. In solchen Linien ist die Ptet-kontrollierte Transkriptionseinheit in einem genomischen Locus integriert, die wir als „still, aber aktivierbar“ (S/A) benannt haben. In dieser Arbeit wurde die Fragestellung bearbeitet, wie die Herstellung von Tet-regulierten Mauslinien effizienter und reproduzierbarer gestaltet werden kann. Das Problem der Locus-Abhängigkeit nach Integration kann z.B. durch das gezielte Ansteuern von genomischen Loci, die eine regulierte Expression unterstützen, vermieden werden. Eine Alternative ist die Verwendung von großen DNA-Fragmenten, die positionsunabhängig nach genomischer Integration optimale Regulationseigenschaften vermitteln. Da bislang weder solche Konstrukte erhältlich, noch Loci mit S/A-Charakter bekannt sind, war es das Ziel dieser Arbeit, einen entsprechenden genomischen Locus funktional zu identifizieren und als BAC-Fragment zu klonieren. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Mauslinie LC-1 als Kandidat zur Isolierung eines S/A-Locus charakterisiert. Tiere dieser Linie tragen eine bidirektionale Transkriptionseinheit zur Expression des Luziferase- und des Cre-Gens. Zur Untersuchung von LC-1-Mäusen wurden verschiedene Transaktivator-Linien eingesetzt, darunter auch Tiere der Linie rTALAP-1, die im Rahmen dieser Arbeit etabliert wurde. Sie besitzt eine gewebespezifische Expression des Transaktivator-Gens rTA2s-S2 in allen Hepatozyten und in Zellen des Nierencortex. Die Analyse der Dox-abhängigen Transgen-Expression in doppelt transgenen tTA bzw. rtTA/LC-1-Tieren zeigte in allen untersuchten Geweben eine stringente Kontrolle der luc/cre-Transkriptionskassette im nicht-induzierten Zustand und eine hohe Aktivierung der beiden Gene ohne Positionseffekte nach Induktion. Diese Linie ist damit nicht nur sehr nützlich als Werkzeug zur induzierbaren gewebespezifischen Rekombination in Mäusen einsetzbar, sondern sie eignet sich auch zur Identifikation des genomischen Integrationslocus. Aus diesem Grund wurde die Integrationsstelle der LC-1-Linie mit flankierenden genomischen Sequenzen als 95 Kb-Fragment in einem BAC isoliert. Teile des BACs wurden sequenziert und so der genomische Integrationsort des LC-1-Transgens identifiziert. Mit dem BAC-Fragment konnten fünf Mauslinien hergestellt und auf ihre Regulationseigenschaften untersucht werden. In allen BAC-Linien war eine Kontrolle der Luziferaseaktivität über mindestens vier Größenordnungen möglich. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass es mit Hilfe der BAC-Technologie möglich ist, die Eigenschaften eines Tet-regulierbaren Locus mit hoher Effizienz zu übertragen und damit die Etablierung von Ptet-kontrollierten Linien durch Mikroinjektion wesentlich zu vereinfachen. Durch die Klonierung des LC-1-Locus wurde außerdem eine genomische Stelle identifiziert, die sich vermutlich generell zur Expression von Tet-regulierten Zielgenen eignet. Durch homologe Rekombination in ES-Zellen kann dieser Locus mit Ptet-kontrollierten Zielgenen angesteuert werden, sodass die Etablierung von funktionalen Linien voraussagbar würde.

Translation of abstract (English)

Experimental approaches that allow to tightly control individual gene activities in mammalian cells and modell organisms have become indispensable for the study of gene function in vivo. The most widely applied system is based on elements of the tetracycline (tc) resistence operon Tn 10 of E. coli it acts at the level of transcription which may be controlled by Doxycycline (Dox). One crucial element of the Tet-system is Ptet, a minimal (i.e. enhancerless) cytomegalovirus IE promoter fused to heptamerized tet-operators (tetO). This promoter is highly activated upon Dox-dependent binding of artificial transcriptional activators (tTA/rtTA) to the tetO-sequences. When a Ptet controlled transcription unit is inserted into the genome of a cell, its function will strongly depend on the properties of the integration site. Upon random integration – a common approach in the generation of transgenic mice - the vast majority of insertions will occur in sites not optimal for tight and broad range regulation via the Tet system. An ideal locus should not influence Ptet in its inactive state while allowing its high activation by tTA/rtTA. Only 5 to 10 % of the genomic integration sites can be expected to exhibit the desired properties, such loci we have termed „silent but activatable“ (s/a). The identification of mouse lines, where a Ptet controlled transcrption unit is properly integrated is time consuming and costly and thus, methods to generate transgenic animals with predictable regulation properties would be of great advantage. One strategy to achieve this goal could be the targeting of defined genomic loci, which would support regulated gene expression. An alternative method could be based on a large genomic DNA-fragments containing genomic loci with s/a characteristics. Due to their size large DNA-fragments usually allow to transmit properties specific for the respective locus. The aim of this doctoral theses was the identification, isolation and characterization of the chromosomal region of a transgenic mouse which fulfills the conditions of a s/a locus. As a candidate mouse line for this task the LC-1 line was chosen and analysed in detail in the first part of the thesis. The LC-1 mouse line contains the luciferase (luc) and the CRE recombinase (cre) gene under the control of a bidirectional minimal promoter (Ptetbi-1). For the analysis LC-1 mice were crossed with different transactivator lines, among them animals of the rTALAP-1- line, which was established during this dissertation. In the rTALAP-1 mouse line the transactivator rTA2s-S2 is produced in hepatocytes and in some additional rather well defined cell populations in the kidney, such as the cortical proximal tubules and the TAL profiles of the inner stripe. The examination showed that (i) there is no CRE mediated recombination in the uninduced state in any cell during development and during 14 months of adulthood; (ii) upon induction, efficient recombination occurs in all tissues examined; (iii) there is apparently no position effect variegation (PEV) connected with the LC-1 locus. In conclusion, the properties of the genomic site, where the Ptet controlled genes are integrated, make the LC-1 mouse line an interesting and probably widely applicable experimental tool for controlling CRE recombination in vivo. Additionally, the LC-1 locus indeed appeared to be a good candidate for generating a vector system for establishing Tet regulatable transgenic mice with predictable properties. For that reason the integration site of the LC-1 line, including flanking genomic sequences, was isolated as a 95 kb BAC-fragment. This fragment was used to generate five transgenic mouse lines, whose regulation characterisitcs were analysed subsequently. All five E11 mouse lines exhibited luciferase expression patterns which closely ressembled the one of the parent LC-1 mouse line. The results show that the 95 kb fragment is capable of transferring with high fidelity the favorable regulation properties of the LC-1 mouse line to other individuals by simple DNA transfer. Thus, the LC-1 locus allows the generation of transgenic animals with predictable Tet regulation properties. The chromosomal integration site of the LC-1 line may also be suitable for direct targeting with Ptet controlled transcription units via homologous recombination in ES cells.